实验四细菌的染色和细菌细胞构造的观察PPT课件.ppt

实验四 细菌的染色和细菌细胞构造的观察 一、实验目的与要求 1.学习微生物涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 2.了解细菌的染色，掌握细菌的革兰氏染色法原理和操作方法。 3.掌握显微镜油镜的使用技术。 二、实验原理与材料 （一）革兰氏染色原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 G+菌与G-菌细胞壁结构比较 （二）实验材料 1．涂片染色用的细菌培养物 (1)巨大芽孢杆菌1号菌（G+）24小时的斜面培养物。 (2)巨大芽孢杆菌6号菌（G-）24小时的斜面培养物。 2．载玻片、接种环、镊子、酒精灯、各种染色液、火柴、无菌牙签、玻璃铅笔、蒸馏水。 3．显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等。 4．示范片： (1)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruringiensis)的芽孢； (2)金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus )。 　 2.革兰氏染色步骤： 1．涂片：将培养24小时的菌样分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2．染色 【每个步骤对时间要把握好】 （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约1min，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖1min，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染1min，水洗。再用吸水纸吸干。 3.镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 ★ 四、实验注意事项 涂片时加水一滴即可，水多涂片难于干燥。 涂片要薄，水滴微混浊即可。涂片太厚，菌液太浓，聚集成堆则难于观察。 革兰氏染色法要严格掌握脱色程度，是此种染色法成败之关键，若脱色时间过度，阳性菌初染时的染色脱去，复染成红色误呈阴性菌反应；若脱色时间不足，阴性菌在初染时的紫色未能脱去，复染时不能染成红色误呈阳性菌反应。 五、实验记录与处理分析 要求：绘出观察结果，加以分析，给出结论 六、思考题 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意那些操作?关键在那几步?为什么? 涂片有水时，为什么不能用油镜观察？ 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？