结核病实验室检测新诊断技术2011课件.ppt

结核病实验室检测新诊断技术介绍省结核病参比实验室 杨丹丹 发光二极管荧光显微镜（LED）方法 液基夹层杯技术 线性探针耐多药检测技术（HAIN） 基因芯片耐多药检测技术（GENECHIP） TB和利福平耐药快速分子鉴定（X-Pert） 一、发光二极管荧光显微镜（LED）方法 适用范围：痰涂片镜检 所需试剂/仪器： LED显微镜、荧光染色液 中盖项目：淮安市（淮阴区、楚州区） 原理： 发光二极管荧光显微镜（LED） 不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍 对数目少的不必使用镜油 节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂片 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加10% 不需要空调设施 不需要暗室 诊断性能优于标准荧光显微镜 寿命长（~ 15-20,000小时） 荧光染色液有致癌作用，推荐自动染色机。 涂片需避光低温保存。 需加强操作人员的培训和质量控制。 成本低廉，价格低于现有的光学显微镜。 适合县、乡级基层实验室使用。 二、液基夹层杯技术 适用范围：痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴 厂家：湖南天骑公司 原理：集菌法 流程图 痰标本消化灭活 基片的夹层杯 离心 细菌附着在基片 在夹层杯中直接染色 取出基片 于载玻片上 镜检 自动阅片计算机报告系统。 所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯（专利）、涂片机、KP21型快速干片机、抗酸杆菌自动阅片计算机报告系统。 三、线性探针耐多药检测方法（HAIN） 适用范围： 1、TB的诊断 2、一线抗结核药物耐药诊断 3、二线抗结核药物耐药的诊断 4、目前，利福平（rpoB基因） 、异烟肼（Kat基因、inhA基因）耐药的诊断 所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、PCR扩增仪、可调温振荡仪 原理：基于分子生物学扩增技术。 rpoB基因突变位点有：4个 Kat基因、inhA基因突变位点有：2个、4个 正确流程 操作步骤 一、痰标本处理 去污染前处理液：氢氧化钠+柠檬酸三钠+N-乙酰半胱氨酸。 痰标本+等体积去污染前处理液：振荡-离心-静置-PBS清洗-离心-留取沉淀。 二、DNA提取 处理后痰标本沉淀 ： 95°C孵育-超声裂解-取上清液用于PCR扩增。 三、扩增产物杂交 PCR产物变性，与探针试条上的标记突变位点杂交，标记物显色。 四、结果判读 HAIN和目前常规药敏方法比较 适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。 基因芯片 将核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚 丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二 维分子排列。 采用光导原位合成或微量点样等方法。 然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。 通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 ， 耐药检测基因芯片 基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。 结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性（利福平、异烟肼）。 rpoB基因突变位点：13个位点。 katG基因突变位点：2个位点。 /inhA基因突变位点：2个突变位点。 耐药分子诊断的基本原理 操作较复杂。 特异度与灵敏度不高。 基因芯片耐多药检测试剂已获得欧盟体外诊断试剂证书（CE-IVD）。 中国药品食品监督管理局的医疗器械证书。 可以作为临床耐药结核病临床诊断和治疗的依据。 五、结核和利福平耐药的快速分子鉴定（x-pert） 适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、利福平耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。 可以在2小时出报告结果。 实验室方法 痰标本的前处理：同前方法。 试剂加入去污处理的痰标本中。 室温下手工晃动密闭痰盒，15分钟内2次，然后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含相当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理的痰液)，检测盒放入检测平台。 MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。 实验室方法 阳性培养物经MPT64抗原检测以确定其是否属于结核分枝杆菌菌属。 L-J培养基比例法药敏 /MIGT 快速药敏法。 常规的DNA核酸扩增 hain方法检测耐药 实验室方法 试剂分别按2:1和3:1加入未