第五章-单克隆抗体.pptVIP

第五章 单克隆抗体 第一节、免疫学基础知识 抗原：可刺激机体产生免疫应答，并可与应答产物结合的外来“异物”。 抗原的两大特点：免疫原性、反应原性 抗原决定簇：又称抗原表位，指位于抗原表面或内部的、具有一定组成和结构的特殊化学基团，能与其相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的结构。 佐剂：与抗原同时或预先注射，可非特异性地增加或改变机体对抗原免疫应答的一类物质称为佐剂。 种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂（弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌）是目前动物实验中最常用佐剂。 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。 一般来讲，脾脏有三大功能： 1.它是 “血库”，当人体休息安静时，它贮存血液；当处于运动、失血、缺 氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量。 2.脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾 脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉。 3.脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。 B淋巴细胞发育过程： 祖B淋巴细胞 前B淋巴细胞 成熟B淋巴细胞 抗原刺激、递呈细 胞和Th细胞作用 活化B淋巴细胞 分化为浆细胞 单克隆抗体：指由单一B细胞增殖分化形成的子代细胞(浆细胞)产生的只识别单一抗原决定簇的抗体。 多克隆抗体：由于一个抗原上往往有多个抗原决定族，会引起多种B细胞增殖、分化形成多种浆细胞，后者分泌的多种抗体混合在一起存在于机体的血清中，又称抗血清。 多抗：制备简单、免疫效果强大，但特异性差。 单抗：均一性好、特异性强。 第二节、单抗制备的技术流程 ①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高； 免疫方案 a. 颗粒性抗原（以细胞性抗原为例）: 　　　初次免疫　1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) 　　　　↓　2～3周后 　　　第二次免疫　　1×10７／0.5ml ip 　　　　↓　3周后 　　　加强免疫(融合前三天)　1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) 　　　　↓ 　　　取脾融合 b.可溶性抗原（免疫原性弱，一般要加佐剂） 　　初次免疫　 Ag　1-50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射 　　　　│　　　　　 　　　　↓3周后 　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip 　　　　│　　　　　　　 　　　　↓3周后 　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip 　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) 　　　　↓2～3周后 　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv 　　　　↓3天后 　　　取脾融合 细胞融合注意事项： 1、细胞比例：脾细胞/瘤细胞约5-10/1。 2、反应时间：慢、转、柔。 3、反应温度：37℃，所有用液均需提前预热。 4、PEG选择：分子量、浓度（30—50%间）。 5、不要使用含有血清的培养基（PEG能引起蛋白质沉淀）。 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法 克隆对象：抗体阳性孔。 克隆化的原则：对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化。 克隆方法： 有限稀释法 有限稀释法原理是从理论上将细胞稀释到10个/ml，然后装成每小孔(96孔板) 0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落。有时为了加快克隆细胞生长速度，常采用腹腔巨噬细胞做饲养层细胞。 饲养细胞 在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过 程中，需要加入饲养细胞。常用的饲养细胞有： 小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞 或小鼠胸腺细胞。 饲养层细胞的作用 提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。 腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。 饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。 目的：保种。 方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整