第五节 酶分子修饰.ppt

4.修饰酶在体内的半衰期 5.最适pH  二、酶分子内部修饰 （一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种： 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部 位，酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。 应用实例： 1）酶原激活 a、胃蛋白酶原的激活 2）提高酶活力： 天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰。从羧基端切除10个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5 倍左右。 3）消除抗原性：（抗原性还与分子大小有关） 木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其肽链的2/3，该酶的活力基本保持。其抗原性却大大降低。 （二）氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。 酶分子的定点突变 （三）金属离子置换修饰 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。 （ 1 ）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。 （ 2 ）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。 常用金属离子 （四）核苷酸链剪切修饰 在核苷酸链的特定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 RNA 5’ GA （五）核苷酸置换修饰 将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸，引起酶的化学结构和空间构象的改变，从而改变核酸类酶的某些特性和功能的方法。 常采用定点突变技术。 例如：L-19IVS活性中心由第22-27位的6个核苷酸残基组成，只要将其中的碱基置换一个，就可以是底物专一性发生改变。（P150表5-2) (六) 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。 举例： 1.纤维素酶经高压处理后，最适温度有所降低，在30℃-40℃条件下，酶活比天然酶提高了10%。 2.盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象破坏，透析出去变性剂后，再在不同温度下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明，50℃条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。 * * 第五章 酶分子修饰 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的种类及应用 第一节 酶化学修饰及修饰目的 一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。 2. 改变酶特性有两种主要的方法： 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。 二、酶化学修饰的目的 （一）研究酶的结构与功能的关系。 （二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应 用范围。 1. 修饰酶的热稳定性 2. 修饰酶的抗原性 3. 修饰酶对各类失活因子的抵抗力 第二节 酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰） 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 2. 修饰剂： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。