308nm激光联合胡椒碱在白癜风动物模型中应用研究.docVIP

308nm激光联合胡椒碱在白癜风动物模型中应用研究 　　[摘要] 目的 探讨308 nm激光联合胡椒碱对豚鼠表皮中黑素细胞的影响，观察联合疗法对实验动物的安全性和疗效。 方法 豚鼠背部分别以联合疗法组、308 nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组及空白对照组作用。5周后对不同观察组脱色区皮肤进行色素生成肉眼观察和皮肤活检。观察治疗前后病理切片中黑素颗粒的改变及黑素细胞数目。 结果 治疗5周后，肉眼观察除空白对照组外，4组均能促进豚鼠皮肤色素沉着。联合治疗组多巴阳性黑素细胞数及黑素颗粒均较其他3组不同程度增多（P 0.05）。结论 308 nm激光联合胡椒碱对豚鼠背部皮肤有明显增色作用，具有促进黑素增值和黑素合成的功能。 　　[关键词] 308 nm激光；胡椒碱；黑素细胞；豚鼠 　　[中图分类号] R758.4+1；R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）28-0013-03 　　白癜风是临床常见的色素脱失性皮肤病，病因及发病机制不明[1]。研究发现，酪氨酸酶在白癜风发病中起关键作用[2]，在正常情况下，其氧化的中间物的破坏作用可能为一种保护机制所消除，一旦缺少此种保护机制，黑素细胞便有被破坏的可能。我们曾对308 nm激光联合胡椒碱对小豚鼠B16黑素瘤细胞黑素合成的影响进行研究，发现308 nm激光联合胡椒碱对酪氨酸酶及酪氨酸相关蛋白酶具有较强的激活及保护作用。在此基础上以棕色豚鼠为动物模型进行动物实验，研究联合疗法对动物的安全性、疗效及作用机制，为今后治疗白癜风患者奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1实验材料 　　健康棕黄色豚鼠10只，重量250～350 g，中国科学院昆明生物所购买。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体、左旋多巴、DAB染料、SP免疫组化试剂盒均由湖北Dr.too生物公司购买，其他试剂为市售合格产品。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 实验分组 分5组。联合疗法组：308 nm准分子激光（EL）以能量300 mJ/cm2照射并联合0.5 mmo/L 胡椒碱；EL激光组：仅以能量300 mJ/cm2照射豚鼠；胡椒碱组：以0.5 mmol/L胡椒碱作用于豚鼠；阳性对照组：EL联合8-Mop（0.1 mmol/L）；空白对照组：仅加入等量相应溶媒，不照射。 　　1.2.2 实验方法 照射方法 豚鼠背部脱毛。随机取4个相离区域，各组累积照射剂量为300 mJ/cm2，照射起始剂量按200 mJ/cm2。以后根据红斑反应适当调整。未出现红斑或发生红斑持续未超过24 h者，加（50～100） mJ/cm2；超过24 h者剂量不变；出现明显反应者，暂停治疗，症状缓解后下次照射剂量减少（50～100）mJ/cm2，每周治疗3次。胡椒碱浓度设定为0.5 mmol/L，8-Mop实验浓度为0.1 mmol/L，2次/d，连续治疗5周，对照射过部位皮肤进行活检，做不同染色。 　　1.2.3 联合疗法对白癜风豚鼠模型脱色区色素生成肉眼观察 肉眼观察色素恢复情况，恢复程度以百分比计。 　　1.2.4 HE染色 常规石蜡切片，苏木一伊红染色。 　　1.2.5 联合疗法对白癜风豚鼠模型脱色区色素生成实验评价 　　（1）黑素合成情况检测 Fontana-Masson法对黑素颗粒进行染色。黑素颗粒分布标准为5级：1级为棘层和基底层细胞少量黑素颗粒；2级为以基底层为主不连续的黑素颗粒；3级为以基底层和棘层为主的连续呈带状分布的黑素颗粒；4级为在3级基础上黑素颗粒呈大量连续的分布；5级为黑素颗粒密布于表皮全层。（2）MC增值情况 Zmokawa染色。用0.1 mol/L PBS液冲洗，置于1 mol/L溴化钠37℃，5 h分离真表皮，PBS洗涤数次，表皮用5%福尔马林固定， 0.1%多巴染色5 h，于显微镜下观察，分别计数5个视野基底层所含多巴阳性数，取平均值。 　　1.3 统计学处理 　　采用成组计量资料F检验，统计过程使用SPSS 10.0统计软件完成。 　　2 结果 　　2.1 皮肤反应 　　联合治疗组治疗5周后，肉眼观察评分为3分，有深褐色色素沉着，空白对照组无明显色素恢复评分为0分。阳性对照组、EL激光组及胡椒碱组均能不同程度促进豚鼠皮肤色素沉着。联合治疗组作用最强。治疗中所有治疗组未见任何皮肤不良反应。 　　2.2 不同观察组对棕黄色豚鼠背部皮肤多巴阳性黑素细胞增殖的影响 　　见表1和图1～5。 结果发现， 4个不同观察组均能不同程度地增高表皮基底层多巴阳性细胞数，其中以联合治疗组作用最明显。联合治疗组作用较空白对照组有显著性差异（t=78.32，P0.05）。 　　2.3 不同观察组对棕黄色豚鼠背部皮肤黑素生成的影响 　　见表1。Fonta