HPLC法测定中药钩藤中钩藤碱和异钩藤碱含量.docVIP

HPLC法测定中药钩藤中钩藤碱和异钩藤碱含量 　　【摘要】 目的：建立高效液相色谱法测定中药钩藤中有效成分钩藤碱和异钩藤碱的含量。方法：色谱柱Lichrospher C18（4.0×250 mm，5 μm），流动相：甲醇：水（含10 mmol/L的三乙胺，冰醋酸调节pH值为7.4～7.6）=55：45，检测波长为254 nm，加入1%盐酸10μL作为改性剂。温度为25 ℃，测定钩藤碱和异钩藤碱的线性关系方程。结果：钩藤碱与异钩藤碱的回归方程分别为Y=9.2×104-0.281×104，Y=7.6×104-0.375×104，线性范围分别为0.100～1.60 μg/mL（r=0.9999），0.211～1.379 μg/mL（r=0.9998），钩藤碱的平均回收率为99.154%，异钩藤碱的平均回收率为99.40%。结论：HPLC法测定中药钩藤中两种成分的含量，方法简单、快速，精密度及稳定性好，可以用于控制中药材钩藤的品质。 　　【关键词】 钩藤； 钩藤碱； 异钩藤碱； 高效液相色谱 　　钩藤为茜草科植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤或者无柄果钩藤的干燥带钩茎枝[1-2]。钩藤为常用的中药，具有清热、平肝熄风功能，评价钩藤及其制剂质量多以钩藤总生物碱或者钩藤碱含量作为指标，测定钩藤碱的方式主要有薄层扫描法和高效液相色谱法[3-4]。本文在上述基础上，流动相中采用三乙胺缓冲液，以同时分离钩藤碱和异钩藤碱的含量，改进后的方法分离度、精密度好，操作简单，条件容易控制。现将测定方法报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与材料 美国Waters公司生产的高效液相色谱仪器：Waters717自动进样系统、Waters 486紫外检测系统、Waters600泵，德国公司生产的色谱柱Lichrospher C18（4.0×250 mm，5μm）；钩藤碱，异钩藤碱，纯度98%（购于上海融禾医药科技有限公司提供，批号分别为120206，120124），甲醇为一级色谱纯，由飞世尔科技（Fisher Scientific）公司提供，水为三蒸水，其他试剂均为分析纯。中药材钩藤购买于北京同仁堂药店（批号201102042011051620111012）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 色谱条件的建立 流动相：甲醇（A）-水（B）（含10 mmol/L的三乙胺，冰醋酸调节pH值为7.4～7.6），流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，进样量为10μL，加入1.0%盐酸10μL作为改性剂，等度洗脱，洗脱比例为A：B=55：45，色谱柱为Lichrospher C18（4.0×250 mm，5μm），柱温为室温。结果见图1。 　　1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取钩藤碱、异钩藤碱标准品2.0 mg，放置于2.0 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容并稀释成浓度约为1.0 mg/mL的溶液，作为标准储备溶液，放置于-20 ℃的冰箱中保存，备用。 　　1.2.3 供试品溶液的制备 取同一批号的中药钩藤，粉碎后过1号筛，精密称取9.9947 g，置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL的80%的乙醇溶液，混匀后浸泡60 min，超声处理40 min，过滤，连续2次，合并提取液，55 ℃水浴中蒸干，80%甲醇定容至20 mL容量瓶中，放置于-20 ℃冰箱中备用。 　　2 结果 　　2.1 标准曲线的建立 分别精密吸取钩藤碱、异钩藤碱对照品溶液10、20、40、80、160μL，甲醇定容至2.0 mL容量瓶中，配制的系列标准品溶液，从低浓度到高浓度依次进样，每个浓度进样3次，按照1.2.1项下的色谱条件，以色谱峰峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线。钩藤碱与异钩藤碱的回归方程分别为Y=9.2×104X-0.281×104，Y=7.6×104X-0.375×104，线性范围分别为0.100～1.60 μg/mL（r=0.9999），0.211～1.379 μg/mL（r=0.9998）。 　　2.2 灵敏度考察 取同一批号的中药钩藤，粉碎后过1号筛，精密称定，置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL的80%的乙醇溶液，混匀后浸泡60 min，超声处理40 min，过滤，连续2次，合并提取液，55 ℃水浴中蒸干，80%甲醇定容至20 mL容量瓶中，放置于-20 ℃冰箱中备用。取空白样品5个平行试验，，测得基线噪音值。同时加入钩藤碱和异钩藤碱标准溶液于空白样品中，按照1.2项下的色谱条件测定，依据信噪比S/N3定位检测限，RSD值分别为2.68%和2.87%，结果表明仪器的灵敏度较高。 　　2.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，按照1.2.1项