内皮抑素结构修饰及修饰后内皮抑素理化性质及生物活性研究.docVIP

内皮抑素结构修饰及修饰后内皮抑素理化性质及生物活性研究 　　摘要目的：采用低分子肝素（MWH）和聚乙二醇（PEG）对内皮抑素（E）进行结构修饰并探讨修饰后E的理化性质和生物学活性寻找一种较好的内皮抑素修饰物。方法：采用高碘酸氧化法活化MWH制得的MWH活化液于pH 9.5、.mol/的NaO-NaHO缓冲液中对内皮抑素进行化学修饰氰脲酰氯法活化PEG活化后的PEG在ph 9.、1mmol/的四硼酸钠缓冲液中进行修饰反应。D电泳监测修饰反应过程比较不同时间点修饰液的自由氨基修饰率、活性保留百分率；用ephadex G-5凝胶过滤层析柱进行分离纯化并进行电泳鉴定；观察内皮抑素及修饰后内皮抑素在5℃和7℃水浴中的热稳定性；建立鸡胚绒毛尿囊膜（AM）模型观察E及修饰后E对AM血管生成的抑制作用。结果：MWH和PEG均能很好的对E进行化学修饰修饰后E能保持较好的活性和稳定性且PEG-E对新生血管的抑制作用优于MWH-E。结论：PEG是一种较好的内皮抑素修饰物。 　　关键词内皮抑素低分子肝素聚乙二醇结构修饰 　　材料与方法 　　实验材料：含内皮抑素基因的重组表达载体工程菌山东大学免疫学研究所提供；MWH（5 ant-a u/mg）中国烟台东诚生化有限公司；PEG-6购自BBI公司；氰尿酰氯（yanuric chiliride）购自igma公司；高碘酸钠天津市科密欧化学试剂开发中心。 　　PEG和MWH对E的化学修饰：采用毕赤酵母表达系统按照文献的方法进行内皮抑素蛋白的表达分离纯化后得到电泳单点纯的内皮抑素。采用氰脲酰氯法活化PEG-6将活化后的PEG-6与内皮抑素（以内皮抑素蛋白含量计）按摩尔比：1溶于ph 9.、1mmol/的四硼酸钠缓冲液中对E进行化学修饰；采用高碘酸氧化法活化MWH制得的MWH活化液于pH 9.5、mol/的NaO-NaHO缓冲液中对内皮抑素进行化学修饰。通过D电泳监测修饰反应过程比较不同时间点修饰液的自由氨基修饰率、活性保留百分率。 　　修饰后E的分离纯化：一定反应时间的修饰反应液经过预处理后上ephadex G-5柱（16cm×6cm）用PH 8、1mmol/的磷酸盐缓冲液进行层析分离。 　　修饰后E对AM血管生成的作用：将分离纯化得到的E及PEG-E、MWH-E用三蒸水分别配制成浓度为5靏/ml溶液。以三蒸水作为空白对照氢化可的松作为阳性对照碱性成纤维细胞生长因子??bG）作为阴性对照以上供试液均用5靘的微孔滤膜过滤除菌。将鸡胚按重量随机分为6组按以下剂量加样：空白对照组三蒸水1靗/只；阳性对照组氢化可的松1靗/只；阴性对照组bG 靗（8AU）/只；E组为E 1霯l+bG 靗（8AU）/只；PEG-E组为1靗+bG 靗（8AU）/只；MWH-E组为1靗+bG 靗（8AU）/只用微量进样器按上述剂量将供试液直接加到鸡胚绒毛尿囊膜上加药后用无菌透明胶带封口标记后放入温度7±1℃的培养箱中保持～6的相对空气湿度继续培养8小时观察结果。 　　结果 　　PEG和MWH对E的化学修饰：不同修饰反应时间内皮抑素的活性变化情况：PEG-E修饰反应开始1小时内皮抑素活性变化较大1～小时变化趋于平缓～8小时又有较大的变化8～小时变化较缓此后活性急剧下降。MWH-E修饰反应开始1小时内皮抑素活性基本不变；1～小时变化较大～小时虽有变化但变化较为平缓；1～小时维持在一个平台基本不变；～8小时又有比较大的变化。修饰过程中自由氨基修饰率随修饰时间的延长而升高与内皮抑素活性的变化相对应。 　　PEG-E、MWH-E的分离纯化：二者经ephadex G-5柱层析后均出现两个洗脱峰经D电泳鉴定可知第一峰为修饰后的内皮抑素蛋白峰第二峰为未被修饰的内皮抑素蛋白峰。对分离纯化后的PEG-E、MWH-E进行D电泳鉴定结果显示纯化后的PEG-E、MWH-E在D左右出现一条单一条带无其他杂带出现显示三种修饰物纯化理想。 　　7℃时内皮抑素及其修饰物的分钟热稳定性大小为PEG-EMWH-EE6分钟后活性保留百分率PEG-E为686MWH-E为59E为991。而5℃时内皮抑素及其修饰物的分钟热稳定性大小为PEG-EMWH-EE保温6分钟后活性保留百分率PEG-E为7967MWH-E为76E为6678。 　　修饰后E对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用：在鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的抑制方面同内皮抑素活性相近两种修饰产物相比以PEG-E效果更佳。 　　讨论 　　内皮抑素作为一种蛋白药物其半衰期短、生物利用度低等特点限制了它的应用。而化学修饰为蛋白质在生物医药和生物技术领域的广泛应用提供了一条新颖而有效的途径。它能够赋予蛋白质和多肽类药物许多优良性能如免疫原性降低或消失不良反应减少半衰期延长物理、化学和生物稳定性增强等。PEG类修饰剂是一类大分