组培指南.doc

一、洗涤技术： 玻璃器皿洗涤：新购置的玻璃器皿，常有游离碱性物质，使用前，先用1%稀盐酸浸泡过夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，晾干备用。已用过的玻璃器皿用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。 塑料用品洗涤：新的塑料器皿打开即用。已用过的塑料器皿冲洗干净，先用2%NaOH浸泡过夜，然后清水冲洗，再用2%—5%盐酸浸泡30min，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。 金属用品洗涤：新的金属器皿用热洗衣粉水洗净，冲洗后擦干即可。1．培养基灭菌：利用常规的消毒灭菌方法，即高温高压湿热灭菌法，保持压力在9.8×104—10.8×104Pa、温度在121，灭菌20—30min； 2．玻璃器皿灭菌：可利用蒸汽高压消毒灭菌或干热消毒灭菌； 3、塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌； ．金属用具灭菌：一般采用灼烧灭菌，即将其浸入95%酒精中，然后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。应注意，在操作期间需多次对各种器械进行灼烧灭菌。 ．接种室灭菌：接种前，用紫外灯照射40min进行空气的消毒灭菌。对接种用的超净工作台，每次接种前用紫外灯照射40min左右，同时用70%—75%的酒精擦洗，然后进行培养材料的接种。 ．外植体灭菌：先用流水冲洗10—20min或更长时间，然后在70%酒精中浸泡30s，再立刻放入0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右或在10%的次氯酸钠、饱和飘白粉浸泡30min左右，然后再用蒸馏水冲洗4—5次，即可。高压蒸汽灭菌的原理：通过加热，在密闭的高压锅内随着水蒸汽压力的不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.105MPa压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度热的芽孢。一般情况下，灭菌在温度121，压力0.105MPa下，保持20—30min即可。灭菌锅有很多种，实验室中手提式高压蒸汽灭菌锅是最常用的，但是在使用时要注意一下几点： 1、以免造成空烧或干烧 2、 3、锅内冷空气必须完全排尽，否则压力表的指针虽然达到了规定的压力，但由于锅内冷空气的存在，并不能达到相应的温度，因而影响灭菌效果。 4、进行培养基灭菌时，锅内达到规定的灭菌温度后，在严格保持灭菌温度的同时，还要严格保持灭菌时间。时间过长会破坏培养基内一些化学成分的有效性，时间过短则达不到灭菌效果。 5、排气降压时应缓慢进行； 6、； 7、高压锅工作时，应有专人看守。 液体容积（ml） 121℃所需时间（min） 20---50 15 75 20 250---500 25 1000 30 1500---2000 35---40 四、组织培养时，植物激素的使用规律 在生长素存在的条件下，细胞分裂素的作用有加强的趋势，但二者在使用上有一定的顺序关系，处理顺序不同，培养物的分化状态也不同。规律如下： ⑴ 先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不容易分化,容易产生多倍体细胞。 ⑵ 先用细胞分裂素处理，后用生长素处理，细胞分裂也分化。 ⑶ 用生长素和细胞分裂素同时处理，细胞脱分化后分化频率提高。但二者的使用浓度比值可以决定器官分化方向：生长素/细胞分裂素比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值适中时，促进愈伤组织的形成和生长。