流式原理-血库讲课831.ppt

流式细胞仪原理 及其应用 流式细胞仪的原理 流式细胞术的基本概念 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 流式细胞仪可告诉我们一个细胞的什么指标? 细胞的相对大小（前向角散射光信号，FSC） 细胞的相对颗粒性及内部结构的复杂性（侧向角散射光信号，SSC） 相关的荧光强度 散射光信号的特征 FSC和SSC 当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。 488nm激光激发产生散射光 散射光信号 外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 荧光信号的特征 什么是荧光信号 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。 荧光信号的特征 发射光的荧光强度与结合的位点成正比 荧光信号的特征 常见荧光染料的发射波长 直方图显示荧光信号 点图显示荧光信号 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器； 流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 BD：FACSCanto2流式细胞仪 光学系统设计特点：?488nm氩离子激光器和633nm氦氖激光器；???采用专利技术的光路设计扩展了可检测的荧光信号（6色荧光参数，2个散色光）；???高灵敏度，更适合检测弱表达或含量极低的指标液流系统设计特点：?采用独立的液流车，提供仪器运行所需的所有液体环境，节省了时间；???与软件配合，使得液流的控制高度自动化，易于操作；???全新设计的样本进样系统使得样本滞留量小于0.1%,更适合微量样本的检测 信号检测系统 八角形和三角形光学收集系统，将光信号转换成电信号 电子系统将电信号转换成数字化信号 数字化电子系统：?无需进行时间延迟校准，系统可以处理更快的样本流动速度（120ul/min)及采样速度（10000events/sed)???简化了荧光补偿的设定，实现了自动补偿和采样后补偿的可能。 液流系统 流动室 鞘液 工作液，可选PBS、血球稀释液或蒸馏水。 样本流 单细胞悬液，浓度5?105?1 ?106/mL 液流系统 鞘液是压力驱动的。在压力作用下，鞘液经过滤器进入流动室下部的小室中。 检测的样本在压力的作用下，也进入流动室下部的小室中，样本压力略大于鞘液的压力。 在鞘液的包裹下，样本由下向上通过流动室，经激光激发后，样本中的颗粒被检测。 液流系统 -FLOW CELL(流动室) 样本流速的选择 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析。 光学系统 染色的细胞或其他颗粒通过聚焦的激光束时，会散射激光或荧光。因为激光束是一个小斑点，颗粒快速通过流动室，散射光或荧光持续的时间非常短-只有几微秒。这些短暂的光信号被收集、过滤，然后被检测器转换成电信号。 信号采集系统 激光 488nm，633nm， 激发样本中的颗粒或细胞产生散射光信号和荧光信号 信号检测组件-八角形和三角形 光学滤片 将激光激发后产生的散射光信号和荧光信号引导至相应的PMT PMT-将光信号转换成电信号 常用荧光染料的特性 常用荧光染料(488nm,633nm激发) Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素 Phycoerythrin (PE) 藻红素 Allophycocyanin (APC) 异藻蓝蛋白 Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) 多甲藻黄素-叶绿素蛋白 Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures) FACSCantoⅡ信号检测组件 检测器 鞘液流中的颗粒通过激光束时会产生光信号，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理。 FACSCanto 两类检测器 光电二极管：FSC 光电倍增管PMT：SS