(生物化学转氨基作用.pptVIP

转氨基作用 一、实验目的 学习转氨酶活性测定方法 熟悉转氨酶在代谢及临床诊断中的作用 掌握纸层析法分离氨基酸的技术 二、实验原理 转氨 氨基酸的分离鉴定 1. 氨基酸的转氨基作(transamination) 在转氨酶(transaminase)的作用下，某一氨基酸去掉α-氨基生成相应的α-酮酸，而另一种α-酮酸得到此氨基生成相应的氨基酸的过程。 重要转氨酶：谷草转氨酶（AST , 天门冬氨酸氨基转移酶——GOP ） 谷丙转氨酶（ALT ，丙氨酸氨基转移酶——GPT ） 正常人各组织GOT及GPT活性 (单位/克湿组织) 血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预后的指标之一。 谷草转氨酶是肝功能检查的一项重要指标 正常情况，AST在心肌细胞含量最高，其次肝脏（线粒体）。血清中含量极少（正常值0-40U/L） 肝脏发生严重坏死或破坏时（各种病毒性肝炎、肝硬变、肝脓肿、肝结核、肝癌、脂肪肝、酒精肝等；心肌梗塞、胸膜炎、肾炎，剧烈运动、过于劳累、过油腻食物等）AST血清中浓度偏高。 ALT升高是肝脏功能受损的一个重要指标 ALT主要存在于肝细胞浆内，血清正常参考值为5.0～49.0U/L 。1%的肝细胞坏死，血清酶增高一倍。——ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。 许多疾病引起ALT增高（急性病毒性肝炎，慢性肝炎、肝硬化活动期、肝癌、肝脓肿，心梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高） 。 ALT活性检测——赖氏法 ALT催化Ala和α-酮戊二酸生成Glu和丙酮酸。丙酮酸在酸性条件下与2，4－二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕红色，在520nm处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。 谷丙转氨酶快速检测条（干化学法） ALT检测卡：全血分离垫 +ALT特异性多层反应垫（包含指示剂, 丙酮酸氧化酶和过氧化物酶） 全血分离区：从全血中分离血清并且支撑其渗入到反应区 反应区：淡蓝色→深蓝色 与比色卡比较最终反应时期的颜色变化。 2. 纸层析(paper chromatography) 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：（物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值） 氨基酸的结构和性质 丙氨酸与谷氨酸 丙氨酸与谷氨酸侧链极性的差异使其在纸层析过程中有不不同的迁移率。 3. 氨基酸的鉴定---印三酮反应 三、操作步骤 1. 酶抽提液的制备 3g新鲜动物肝脏，剪碎。 匀浆：1+2ml冷 1/15mol/L pH8.0磷酸缓冲液，冰浴匀浆5-10min。 离心（1.5ml管）：14000rpm/min，4℃，10min，收集上清液——酶抽提液。 3. 点样 毛细管点样：每一样品点3次 4. 层析 A、E：15cm平皿 B：层析滤纸 C：滤纸芯 D：6cm平皿，5-10ml 水饱和酚 * 展层2h 5. 显色及结果分析 吹干层析滤纸 向层析滤纸上喷洒茚三酮（0.1%乙醇溶液） 60-80 ℃干燥层析滤纸5-10min 计算各氨基酸Rf值，鉴定样品1、2中的氨基酸 思考题 影响纸层析中样品迁移率的主要因素有哪些？ 层析结果背景过高（泛红或局部不洁）的可能原因是什么？ * 纸层析 印三酮反应 (Donor amino acid) (New keto acid) (Accepter keto acid) (New amino acid) 2 2 1 1 GOT Glu Pyruvate α-Ketoglutarate (α-KG) Ala GPT ELISA检测ALT Rf ＝ 原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 原点 前沿 原点 Ala Glu α-酮戊二酸 15滴 丙氨酸 15滴 碳酸氢钾 15滴 碘乙酸 8滴 酶抽提液 15滴 1 酶抽提液 15滴 三氯乙酸 15滴 α-酮戊二酸 15滴 丙氨酸 15滴 碳酸氢钾 15滴 碘乙酸 8滴 三氯乙酸 15滴 2.转氨基反应 37℃水浴2h 离心取上清 2 沸水煮10min 37℃水浴2h 离心取上清 1 4 2 3 1：标准Ala 2：标准Glu 3：1号管 4：2号管 滤纸条沿纵 轴捻成灯芯