基层培训免疫学技术.ppt

2、操作和反应步骤 （1）双抗体夹心法 以测定HCG为例，如图1所示，试条中G区为金标记的鼠抗人HCG，T区为包被的抗人HCG，C区为包被的羊抗小鼠IgG抗体。 ①测试时在A区滴加尿液（或将A区浸入尿液中），通过层析作用，尿液向B区移动，流经G区时将金标记抗HCG复溶，若尿液中含HCG，即形成金标记抗HCG和HCG复合物。 ②尿液继续移行至T区时，HCG复合物与抗HCG结合,形成金标记抗HCG-HCG-抗HCG复合物，金标抗HCG在T区显示红色线条，为阳性反应。 ③多余的金标记鼠抗人HCG抗体继续移行至C区时，被羊抗小鼠IgG抗体捕获，而显示出红色质控线条。如尿中不含HCG，在T区不出现红色线条，仅在C区出现红色线条，表示试验结果为阴性。如C区无红色线条出现,表示试验失败，可能为试剂条失效。见图3。 图1 斑点金免疫层析试验 图2 斑点金免疫层析试验双抗体夹心法原理示意图 竞争法原理示意图 图3 斑点金免疫层析试验（双抗体夹心法）结果判断示意图 （1）测定时待测标本加于A区，若待测标本中含有抗原，流经G区时结合金标抗体，形成待测抗原和金标记抗体复合物。 （2）当复合物移至T区时，因无足够的游离金标抗体与膜上标准抗原结合，T区无棕红色线条出现，结果为阳性。若标本中不含待测抗原，游离金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的条带，实验结果为阴性。 游离金标抗体或金标抗体复合物流经C区时，与该区包被的抗体结合出现棕红色的质控带，若C区无红色条带出现则为试剂失效。 （三）临床应用及评价 1、临床应用 （1） 感染性疾病抗原、抗体的检测 可检测的抗原有：HBsAg、HBeAg、大肠埃希杆菌抗原等。可检测的抗体有：抗- HBs、抗-HIV抗体、抗结核杆菌抗体、抗幽门螺杆菌抗体等。 （2）?各种蛋白质的检测 如血清中的肌红蛋白、肌钙蛋白、甲胎蛋白、尿微量白蛋白、粪便血红蛋白等。 （3）?激素的检测 包括人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促甲状腺激素（TSH）、促黄体生成激素（LH）。其中尿液HCG的检测应用最广，产品品种最多。 （4）?药物的检测 主要检测毒品类，如可卡因、吗啡等。 2、方法特点和评价 （1）本法具有操作简便、快捷，单份标本测定，立等可取，无需特殊仪器设备，试剂稳定、便于保存等特点，因此多用于急诊检验、床边检验（POCT）和家庭检验等。 （2）本法灵敏度不及酶标法和发光免疫测定法，只能用于急诊快速检测，不能作为确诊的检查项目。在临床应用中应引起高度重视。 （3）该技术目前尚不能准确定量，只能作为定性或半定量试验，主要应用于正常人体中不存在的物质，如传染病抗原或其相应的抗体以及毒品等；正常人体含量极低而在妊娠、疾病等特殊情况下异常升高的物质如HCG、AFP等的检测。 注意事项： 本法检测出阳性主要为IgM类RF，阳性血清可连续双倍稀释测效价。每次试验均应设阴、阳性对照。其它见胶乳凝集法注意事项。 第三节???酶联免疫技术及应用 ? 一、酶免疫分析技术 酶免疫分析技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术中使用最广泛的一种方法，具有灵敏度高、特异性强、酶标记物有效期长等优点，现已被广泛应用于医学检验和生物学的各个领域。 （一）原理和分类 酶是催化化学反应的蛋白质，它具有高效性和专一性的特点。酶免疫分析技术是将酶的催化放大作用和抗原抗体反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后，既不影响抗原或抗体免疫反应的特异性，也不改变酶本身的活性。免疫反应进行以后，酶还能催化相应的底物显色，最后利用酶标仪检测颜色的深浅来进行定性或定量分析。显色反应显示酶的存在，表示结合或游离的酶标抗原或抗体的量的变化。 根据反应过程中是否将结合的酶标记物和游离的酶标记物分离，把酶免疫分析技术分为两类：非均相酶免疫测定和均相酶免疫测定。非均相酶免疫测定抗原抗体反应平衡后，将游离的酶标记物和与抗原抗体结合的酶标记物分离开，再通过底物显色进行测定。其代表技术是酶联免疫吸附试验（ELISA）。而均相酶免疫测定由于免疫反应后酶活性的改变，不需将游离的和结合的酶标记物分开。主要用于小分子物质的测定。 （三）常用的标记酶和底物 （1）辣根过氧化物酶（HRP） 其分子量较小，溶解性好，易于提取，来源广泛；酶和酶标记物性质稳定，耐热、耐有机溶剂作用，易于保存，价格低廉；易于标记，标记后活性损失很小。因此HRP是ELISA中应用最广的标记用酶。 HRP底物种类很多，主要有邻苯二胺（OPD）和四甲基联苯胺（TMB），前者由于显色不稳定，对机体有一定致癌性，已逐渐被TMB所替代。 （2）碱性磷酸酶（ALP）和酶底物 （3）β-