第四章 酶的分离纯化1.ppt

五、几种层析分离方法 （一）吸附层析 利用物理吸附剂对不同物质吸附能力的不同而使混合液中各组分分离的方法。 1、原理 2、吸附剂 的种类和特点 （1）种类：活性氧化铝、硅胶、硅藻土、碳酸盐、活性碳、陶土、纤维素等。 （2）特点： ①来源丰富、价廉、可再生、吸附设备简单。 ②有些吸附剂使用前要预处理，以除去杂质，提高吸附力，增强分离效果。 ③上样时低pH值和低离子强度，半小时后提高pH值和离子强度洗脱。 3、吸附的三个基本环节：加样、吸附、洗涤或洗脱。 4、洗脱方法： （1）溶剂洗脱法： （2）置换洗脱法： （3）前缘洗脱法： （二）离子交换层析 1、原理 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种分离方法。 2、离子交换剂 （1）根据母体不同可分为 离子交换树脂：交换容量不大，易使酶失活 离子交换纤维素：最广泛的一类 离子交换凝胶：不耐高流速洗脱 根据活性基团性质不同可分为 阳离子交换剂：能吸附带“+”的离子或酶 -CM-（羧甲基）、-PO32-（磷酸基）、-SO3-（磺酸基） 阴离子交换剂：能吸附带“-”的离子或酶 -DEAE（二乙基氨基乙基）、-TEAE（三乙基氨基乙基） 3、离子交换反应 蛋白质/酶在不同的pH条件下，将发生不同的离解作用，而带不同的电荷，选择相应的离子交换剂。 4、操作要点 （1）装柱：湿法装柱，离子交换剂上样前抽气泡。 （2）加样、平衡：1%~5%上样量。 （3）洗脱、收集：梯级洗脱（分时段改变洗脱液的pH或盐离子强度）、梯度洗脱（连续改变pH或盐离子强度）。 （4）再生：离子交换剂要再生，和预处理程序相同。 练习 1、下面哪一种不能作为离子交换剂用于分离纯化酶？（ ） A、DEAE-Sephadex B、CM-纤维素 C、TEAE-Sepharose D、Sephadex G50 2、某酶的等电点为6.8，若采用DEAE-纤维素进行离子交换分离，可选择下面哪种pH的缓冲液上柱？（ ） A、pH为5.0的缓冲液 B、pH为6.8的缓冲液 C、pH为8.0的缓冲液 D、都不行 （三) 凝胶过滤层析gel filtration chromatography 1、原理 利用各组分分子量大小不同，从而在凝胶网孔中流速不同达到分离的目的。 2、常用的凝胶种类 （1）葡聚糖凝胶 Sephadex G-X X—表示每克干胶的吸水值的10倍 吸水值越大，分子量范围越宽 （2）琼脂糖糖凝胶 Sepharose 2B、4B、6B 2B、4B、6B表示琼脂糖含量为2%、4%、6%，浓度越高，凝胶网眼孔径越小，分布的大分子相对分子质量越小，范围越窄。 （3）聚丙烯酰胺糖凝胶 Bio-Gel P-2、4、6、…….、200、300，共10种型号。 P后的数字表示分离的最大相对分子质量（×103）。 3、操作要点 （1）、装柱前要吸胀和抽气。常温吸胀需较长时间，可加热溶胀。 （2）、加样量不超过3%。 （3）、洗脱液应与平衡时的溶液一致。 （4）、无须经过再生处理。 （5）、长期不用时，可加0.02%的NaN3保存。 4、凝胶层析测定蛋白质（酶）的相对分子质量 不同分子之间的分离，是它们在内水和外水之间的一种分配行为，流出柱的先后，用分配系数Ka作定量描述： Ka =（Ve - Vo）/Vi Ve——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积 Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积 Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和 当Ka=0时，Ve=Vo，全排出的大分子 当Ka=1时，Ve=Vo+Vi，是全受阻的小分子或无机离子 Ka=0~1时，其他大小介于两者之间的分子 Ve——洗脱体积，指从洗脱开始到某一组分流出峰值时所用洗脱液体积 Vo——外水体积，柱床中凝胶颗粒之间的空隙体积 Vi——内水体积，凝胶颗粒内部空隙体积的总和 Ka值最小的，最先流出； Ka值最大的，最后流出。 同一个凝胶床，内水体积和外水体积（Vo和Vi）为定值，因而洗脱体积（V e）小的，就是相对分子质量大的。 Ka = Ve - Vo Vi Ve = -K2 lgMr + K1 Mr——相对分子质量 蛋白质分子量与凝胶层析洗脱体积的关系 Ve lgMr · · · · 用一组已知相对分子质量的蛋白质进行实验，作出上图，然后对未知相对分子质量的蛋白质（酶）在同一凝胶柱上实验，测得Ve，就可以查标准曲线算出它的相对分子质量。 练