核磁共振谱在药物定量分析中的应用的研究.doc

PAGE PAGE 40 核磁共振谱在药物定量分析中的应用研究 项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心 项目完成人：贺文义 1、核磁共振1H谱检测康爱新生素胶囊甲基素的含量方法建立 药物胶囊是常用药物剂型的一种，通常对其中主要成分的检测是用色谱法或化学滴定等方法，比较费时和费力，康爱新生素胶囊中主要成分为甲基素。根据该化合物的1H谱特征峰，用TMS为外标（1‰ TMS /CDCL3），甲基素为内标，取胶囊5粒，将内空物充分混合，定量称取五份（10±mg）用1ml CDCL3溶解，温控25℃，D1=15秒，nt=8测试1H谱，经积分后按公式计算出胶囊中主要成分的含量。 实验方法：取胶囊五粒，将内容取出充分混合，将定量称取五份（±10mg）,每份用1 ml CDCL3溶解，温控25℃，D1=15秒，nt=8测试1H谱。另称取甲激素±10mg在相同条件下测试1H谱，图谱以TMS为内标积分值定为10，δ1.31峰作为基准以其积分值计算甲激素含量。 计算公式：C=Ma0/Sa0=10.01/83.22=0.12 注：M=样品量（mg） Ma= Sa×C Sa=特征峰面积积分 甲激素在胶囊中的含量=MA/M×100% 2．用HPLC-NMR联用技术鉴定同分异构体 羧基荧光素（caboxvfluorescein）是荧光素衍生物的一种，其产品中同时含有5-FAM（caboxyfluorescein-5-succimidyl ester）和6-FAM（caboxyfluorescein-6-succimidyl ester），5-FAM较6-FAM更经常使用。其广泛存在于荧光标记试盒，用于DNA自动测序。本品采用Varian公司的Prostar-230D2O，CH3OH（0.1%冰醋酸），其洗脱比例70:30，流速为1ml/min，检测器为Varian Prostar-330二极管振列检测器，紫外检测波长为242nm。测得保留时间10.466m,11.906m两个峰。LC-MS所得到分子量均为376。在INOVA-500 LC-NMR上，用停止流动的方法采集LC-NMR 1H谱。进样量为25 ?l（2mg/200 ?l），1H谱采样时间为1.5 s，累加次数为256。通过1H谱分析,确定保留时间10.466min为6-FAM,11.906min为5-FAM.混合物1H LC-NMR谱图。 b b 图1. 羧基荧光素混合物1H LC-NMR谱a.tR=10.5min,b.tR=11.9min 3、高分辨魔角核磁共振技术定量跟踪N?-Fmoc保护的羟基氨基酸的糖基化反应 1）概述 九十年代初发展的高分辨魔角核磁共振技术(High resolution magic spinning(HR/MAS)NMR)采用魔角旋转消除非均相溶液中磁化率不同而造成的谱线加宽。另外特殊设计的超微量探头(gHX Nano Probe)与常规的高分辨液相探头不同，体积很小的样品(40μL)可以100%地保持在检测线圈内，填充因子高，样品管和塞子磁化率匹配性好，致使磁化率的不连续性达到最小，从而得到最高灵敏度和最小线宽的NMR谱图。该技术不破坏样品，可灵敏、直接地提供偶联在树脂上化合物的结构信息。目前，广泛用于监测固相合成反应；鉴定固载在单一树脂珠上化合物的结构；以及分析树脂上固载化化合物的构象等等。 该项目首先探讨了不同常规树脂、不同溶剂以及温度对高分辨魔角核磁共振技术中1H NMR线宽的影响，然后利用该技术指导优化N?-Fmoc保护的羟基氨基酸固相糖基化反应的条件，并利用该技术定量研究不同N?-Fmoc保护羟基氨基酸的固相糖基化反应。 固相组合合成糖肽库是十分热门的研究领域。该项目将N?-Fmoc保护的羟基氨基酸偶联到Teata Gel S NH2 树脂上，再在过量的乙酸化糖三氯亚氨酯供体和BF3. Et20 的催化条件下进行固相糖基化反应。用HR/MAS NMR分析技术不仅跟踪优化了固相羟基氨基酸的糖化反应条件，而且选择固载在树脂上的糖基化N?-Fmoc保护羟基氨基酸1H NMR中最低场，且分辨好的Fmoc保护基信号做为内标，糖上乙酸基的积分面积为标准直接定量了键合在Teata Gel S NH2树脂上氨基酸苷化的产率。利用四个羟基未保护的N?-Fmoc氨基酸和七种全乙酰化糖为原料，合成了28个糖基化N?-Fmoc氨基酸，均用高分辨魔角核磁共振技术定量。该研究为进一步合成“一株一化和物”的糖肽库打下了坚实的基础。 2）结果与讨论 A 树脂、溶剂和温度对1H NMR线宽的影响 有机合成中使用的固相载体有赖于两个相互关联的部分：① 不溶解但可溶胀的高聚物材料，并且该材料对合成中使用的条件是惰性的；② 将底物与以上固相载体相连，并利于中间体和终产物从固相载体