第22章免疫学检测技术PPT课件.ppt

(2)迟发型超敏反应检测 2.B细胞功能测定 单扩 ELISA 速率比浊法测定各类免疫球蛋白含量 抗体形成细胞测定 （2）溶血空斑试验 原理： 临床应用与评价 溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响 评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。 　 B细胞抗体形成功能的检测 ——酶联免疫斑点法 原理： 应用与方法学评价： 该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。 优点： 稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。 ELISPOT技术简介 酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。 ELISPOT的基本原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与酶标记（例如碱性磷酸酶）的亲和素结合。底物（BCIP/NBT，产物为蓝紫色）孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 酶联斑点分析系统对斑点分析后得出结果。 稳定、特异，且抗原用量少 可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞 ELISPOT检测抗体分泌 ELISPOT分析系统 酶联斑点读板仪 4 )发光免疫分析 (luminescence immunoassay LIA) 将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量免疫分析技术。 优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的高灵敏度。 化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母 化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定 5 )免疫胶体金技术 用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法 6 )免疫印迹法（Western blotting） 该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫技术测定。 常用于检测多种蛋白质 免 疫 印 迹 法 示 意 图 4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列 是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。 原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。 第三节 免疫细胞功能的检测 免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离 (一)外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 不同细胞密度不同 人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 用1.077±0.001的分层液可将细胞分离 　 密度梯度离心(Ficoll)离心　 （二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析 免疫吸附分离法 免疫磁珠法 荧光激活细胞分离仪分离法（ (Fluorescence Activated Cell Sorting)， FACS ） 抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL 2. 免 疫 磁 珠 细 胞 分 离 免疫磁珠法细胞分选过程 3.荧光激活细胞分离仪分离法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 全自动细胞分选系统 流式细胞分析仪 流式细胞仪的工作原理和基本结构 待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。 流动室充满IsoFlow ，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。 液柱与激光束相交，