出口食品中四环素族抗生素残留量检验方法.docVIP

出口食品中四环素族抗生素残留量检验方法 　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了出口食品中四环素族抗生素残留量的检验方法。 　　本标准适用于出口肉或肉制品中四环素族抗生素残留量检验。蛋类和水产品可参照使用。 　　2　设备和材料 　　　平皿：内径为90mm,底部平整光滑,具陶瓷盖。 　　　不锈钢小管(即牛津杯,简称小管)：内径6±,外径±,高度10±。 　　　游标卡尺：测量抑菌圈直径用。 　　　均质器或乳钵。 　　　离心机：4000r/min。 　　　恒温水浴锅。 　　　恒温箱：30±,隔层必须水平。 　　　电热干烤箱:170±1,器皿灭菌用。 　　3　培养基及试剂 　　　培养基 　　　菌种培养基 　　胰蛋白胨　　 　　牛肉膏　　 　　氯化钠　　 　　琼脂　　14～16g 　　蒸馏水　　1000mL 　　将各成分加热溶解于蒸馏水中,高压灭菌(121,15min),最终pH应为±1。 　　　检定用培养基 　　胰蛋白胨　　　 　　牛肉膏　　 　　酵母膏　　 　　琼脂　　14～16g 　　蒸馏水　　1000mL 　　将各成分加热溶解于蒸馏水中,高压灭菌(121,15min),最终±。 　　　试剂 　　　c(KH2PO4)＝/dm**3磷酸盐缓冲液():精确称取磷酸二氢钾(分析纯)溶解于蒸馏水,并定容至1000mL。高压灭菌(115,30min)。置4冰箱中保存。 　　　生理盐水:称取氯化钠,溶解于1000mL蒸馏水中,高压灭菌(115,30min)。 　　　标准抗生素：四环素(TC),土霉素(OTC),金霉素(CTC),从中国药品生物制品检定所购买。要密封避光,防潮保存在4冰箱中。 　　　标准抗生素原液和稀释液 　　　原液 　　a.　四环素原液：称取50mg左右四环素标准品,用c(HCl)＝/dm**3盐酸稀释并定容至1000μg/mL。 　　b.　土霉素原液：称取50mg左右土霉素标准品,用c(HCl)＝/dm**3盐酸溶解之,再用蒸馏水稀释并定容至1000μg/mL。 　　c.金霉素原液：称取50mg左右金霉素标准品,用蒸馏水稀释并定容至1000μg/mL。　　 　　以上原液保存在4冰箱中,可使用7d。 　　　稀释液 　　a.四环素稀释液：取上述原液用c(KH2PO4)＝/dm**3磷酸盐缓冲液稀释配制成,,,,,μg/mL的稀释液,为制备标准曲线的最终标准浓度溶液,μg/mL的稀释液为参考浓度溶液。 　　b.土霉素稀释液：与四环素稀释液相同。 　　c.金霉素稀释液：取上述原液用c(KH2PO4)＝/dm**3磷酸盐缓冲液稀释配制成,,,,,μg/mL的稀释液,为制备标准曲线的最终标准浓度溶液,μg/mL的稀释液为参考浓度溶液。 　　以上稀释液均在使用当天配制。 　　4　样品制备 　　取肉样品约20g,剪碎,称取其中加入c(KH2PO4)＝/dm**3磷酸盐缓冲液,小心搅匀,放置60min,置灭菌的均质杯中(9000～10000r/min)均质2min(或置灭菌的乳钵内研磨呈乳糜状),经4000r/min离心30min,其上清液作为被检样液。 　　5　菌液和检定用平板的制备 　　　菌液的制备 　　菌种：蜡样芽孢杆菌,菌号63301,由中国药品生物制品检定所提供。 　　　菌液的制备：将菌种移种于盛有300mL菌种用培养基的克氏瓶内,30培养7d,镜检芽孢数达85％以上,用25mL生理盐水洗下菌苔,置于65恒温水浴加热30min,经离心(2000r/min)20min,弃去上清液,再加生理盐水,经离心弃去上清液,如此重复洗涤芽孢悬液三次,再置于65恒温水浴中加热30min,然后用50mL生理盐水制成芽孢悬液。置4冰箱中可保存30d。 　　芽孢悬液用量的测定：在实际检定前,先试几个平板,即把不同浓度的芽孢悬液加入检定用培养基中,使μg/mL浓度的标准四环素稀释液可产生12mm以上的清晰、完整的抑菌圈而获得最适宜芽孢悬液用量。一般用量为每100mL检定用培养基内加至或芽孢计数后使悬液含芽孢数约为10**6。 　　　检定用平板的制备：将适量芽孢悬液(已于条中确定)加到溶化后冷却至55～60的检定用培养基中,混匀,每个平皿内加入6mL,前后摇动平皿,使含有芽孢的检定培养基均匀覆盖于平皿表面,置水平位置,盖上陶瓷盖,待凝固后,每个平板的培养基表面放置6个小管,使小管在半径为的圆面上成60°角的间距。所用平板须当天制备。 　　6　检定 　　　标准曲线的制备 　　标准曲线上的每个标准浓度取3个检定用平板为一组。在每个检定用平板上的其中3个小管内加满参考浓度溶液,另3个小管内加满标准浓度溶液,参考浓度与标准浓度溶液要间隔放置,5个标准浓度共用15个检定用平板,含量最低的标准浓度(四环素和土霉素为μg/mL,金霉素为μg/mL)的3个检定用平板作为