动物细胞-组织培养常见的一些问题.docVIP

动物细胞/组织培养常见的一些问题 　　由于影响因素过多，细胞/组织培养中出现的一些问题往往很难分析并得到解决，因此被人戏称为“黑色艺术”或“巫术”。本文列举了一些动物细胞/组织培养中常见的问题及解决方法。 　　1.培养试剂的保存： 　　血清：-5oC--20oC保存，避免反复冻融。 　　培养基:2oC–8oC避光保存。 　　完全培养基:2oC–8oC避光保存，并在2周内用完。 　　尽量缩短血清和培养基见光的时间 　　2.液体培养基中谷氨酰胺使用方法： 　　很多细胞生长要求在培养液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20?C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4?C冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。另一种选择是使用L-谷氨酰胺的衍生物-L-alanyl-L-glutaminedipeptide替代L-谷氨酰胺。Glutaplex与L-谷氨酰胺相比更加稳定，降解比较慢，提高细胞的存活和生长，极大降低对细胞有毒性的氨的积累。 　　3.培养基中是否应加酚红： 　　酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，特别是雌激素。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，应使用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加酚红的培养基。 　　4.使用血清应注意的问题： 　　1）血清第一次使用前，是否应在56oC，30分钟加热血清以灭活补体系统？ 　　激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞生长只有微小的促进或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染。而把血清放在37环境中又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量。 　　2）通常使用的血清的种类： 　　新生牛血清：新出生牛5天内取血制成。小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。胎牛血清：要求剖腹取胎制成。国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为：特级胎牛血清：40纳米过滤，内毒素含量≤10EU， 　　血红蛋白含量≤10mg/dl。优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤25mg/ml。标准胎牛血清：3次100纳米过滤，低内毒素，低血红蛋白含量。 　　3）为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 　　有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。建议在-20储存胎牛血清，避免反复冻融。 　　4）血清解冻后发现有絮状沉淀物出现： 　　血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成。而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存在于血清中，也是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。 　　5）如何避免沉淀物的产生? 　　我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: 　　(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2至4过夜，37oC水浴解冻)。若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时要随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)如果在高于40oC的水浴中融化并且不时常摇晃混匀，非常容易造成沉淀物增多。同样血清的热灭活也造成沉淀增多，若非必要，可以省去热灭活。(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。 　　5.培养用液pH对细胞生长的影响： 　　由于，大多数细胞培养适宜的pH为，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受力差，无限细胞系耐受力强