预防医学荧光定量课件.ppt

实时荧光PCR技术原理 李庆阁 厦门大学分子诊断实验室 1、PCR技术 PCR (Polymerase Chain Reaction) —聚合酶链式反应 1985年K. Mullis发明PCR技术，并因此获得诺贝尔化学奖。 PCR 原理 三步曲  第一步：加热变性 靶序列 PCR 原理 三步曲 第二步：退火，引物特异地与靶 序列结合 PCR 原理 三步曲 第三步：延伸，DNA聚合酶在引 物引导下，按照靶序列复制 PCR 原理靶序列的大量扩增 PCR技术——基本特点 灵敏度高 （HBV为例） 抗原、抗体 核酸杂交 PCR法 检测灵敏度 ng/ml pg/ml fg/ml 特异性强 快速简便? 对样品要求低 样品来源非常广泛 不需分离靶序列 极微量模板 PCR技术——局限性 假阳性： 样本间交叉污染、 PCR扩增产物污染 非特异性扩增产物。 解决方案： 防污染 杂交探针 PCR技术—扩增产物分析 熔解曲线(Dissociation curve) 实时荧光PCR—SYBR Green I 检测 优点（1）技术简单、方便，而且可适用于任何PCR反应； （2）目前主要用于熔解曲线分析 缺点：非特异性结合。 SYBR Green I 也可与非特异性的双链结合如引物二聚体，非特异性PCR扩增产物等。 实时荧光PCR—TaqMan技术 优点：杂交效率高 缺点：(1)淬灭难以彻底，本底较高； (2)探针的水解依赖于Taq的酶外切活性，故定量时受酶性能和试剂质量影响； (3)检测点突变的能力相对不足。 Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E5.A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization.Li Q, Luan G, Guo Q, Liang J.The Key Laboratory of Cell Biology and Tumor Cell Engineering of the Ministry of Education, Xiamen 361005, Fujian, China. qing@phri.nyu.edu We have developed a new class of probes for homogeneous nucleic acid detection based on the proposed displacement hybridization. Our probes consist of two complementary oligodeoxyribonucleotides of different length labeled with a fluorophore and a quencher in close proximity in the duplex. The probes on their own are quenched, but they become fluorescent upon displacement hybridization with the target. These probes display complete discrimination between a perfectly matched target and single nucleotide mismatch targets. A comparison of double-stranded probes with corresponding linear probes confirms that the presence of the complementary strand significantly enhances their specificity. Using four such probes labeled with different color fl