实验 0Y 果蝇遗传标记分析-PAPD185.ppt

四、实验材料-步骤 : （1）D.Virilis ------------10只 （2）黑腹果蝇--P♀、P♂、 F1♀、F1♂、 F2♀、F2♂各40只 （3）其他材料 -- 0.2g 1份（7种果蝇样品+1种其他）/小组 （1）、（2）的P、（3）由教师提供，（2）F1、F2用自己存的材料。 已经制备匀浆液 ,一半已经用于同工酶实验 * fhfh ?制备DNA粗提液： 每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其他材料0.2g） +400μL匀浆缓冲液匀浆 匀浆液200μL 匀浆液200μL 用于RAPD实验提取DNA （冰浴操作） 液体倒入1.5ml离心管 +22μL SDS、2μL的蛋白酶K 翻转混匀（动作要轻）→55℃水浴 2h →存-20℃ 用于同工酶实验 已完成 第一周做到此步 * fhfh 一周后的实验课及课余时间: -20℃中取出的样品 +RNA酶至200μg/mL，37℃ 0.5~1h 等V酚/氯仿/异戊醇（25﹕24﹕1）抽提 (慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大 ) 冰浴10min 4℃ 12000rpm 离心5min 1.5ml新EP 上清（水相）至 等V氯仿/异戊醇（24﹕1），轻混匀 冰浴10min 4℃ 12000rpm ，5min 1.5ml新EP 上清（水相）至 等V异丙醇，轻轻混匀 白色线团状物 4℃ 12000rpm ，5min 弃上清 为省时老师代做此步 * fhfh 70%酒精洗涤 4℃ 12000rpm ，5min 弃上清 +100μl TE 溶解 室温干燥（不要太干，否则DNA不易溶解） 0.6%Agarose电泳检测DNA质量 (免) 2. RAPD反应 1‘．在0.2ml PCR管中配制25μl反应体系 （2次） 随机引物 1μl dNTP Mixture 2μl Taq酶 0.2μl 10×PCR buffer 2.5μl ddH2O up to 24μl 全班一人负责配齐（此配方×64，见下页） 每桌一人领取16份样品所需量 平均配给两组 各组等分8份 分别加8种样品的模板DNA 各 1μl * fhfh 随机引物 64μl dNTP Mixture 128μl Taq酶 12.8μl 10×PCR buffer 160μl ddH2O up to 1536μl （即1.536 mL） 反应体系64倍量（除模板外）： * fhfh 2’．在PCR热循环仪中进行如下反应： 94℃ 200s→ 94℃ 60s→36℃ 60s→72℃ 120s 40个循环 →72℃ (300s--600s) 尽量成批与老师约时间 3．电泳 2%琼脂糖凝胶电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。 * fhfh 操作分工 技术问题 注意事项 助教指导： 实验作业（写在实验记录本上）： 1. 简述RAPD的实验原理、解决的问题； 2.将你的实验结果画（剪贴）在记录本上，标出样品名称、差异条带等；你的实验结论是什么？ * fhfh 补充知识（课后阅读）： RAPD RFLP AFLP STR SNP * fhfh 利用10个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增DNA片段，一般一个引物可扩增6-12条DNA片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。 RAPD是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。 RAPD * fhfh * fhfh * fhfh 是英文Restriction Fregrmeat Length Po1ymor— Phism的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。 RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。