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免疫组化照片 注意事项 1．载玻片上的组织不可太干燥，可用二甲苯保持组织 的湿度，在切割前使二甲苯蒸发。 2．采用冰冻组织切片进行显微切割时应注意切片的厚度，一般在4~10um为宜。 3．在切割前可将切片浸在3%的甘油内30s，这样可以降低组织的脆性，并且较容易移取切割下的组织成分。 4．在每次切割前，应先进行收集器，PCR管盖底观察位置焦面，激光切割线的校准，并在空白处进行预切，以检查参数设置是否妥当，更换物镜后应再次检查参数。 应用图像分析的注意事项 （1）应选择无疵点，无污渍的薄厚均匀的载玻片和盖玻片。 （2）使用相同的封片剂。 （3）严格控制切片的厚度和染色条件的一致。 （4）测量光密度的样品最好不要复染，尽量减少样品染色 的不一致或不均匀。 （5）图像获取时光的条件要求严格一致，尽量用40倍的物 镜采集图像，以便测量时精确分割图像。 MTT实验注意事项： 1. 设空白调零孔，即只加培养液，不加细胞。 2. 每组平行设3-6孔。每组细胞密度一致。 3. 吸取培养液上清时，枪尖不能接触细胞底部。如是悬浮生长的细胞，一定要离心后再吸上清液。 4. 检测前，要震荡摇匀。 流式细胞仪原理 概念 流式细胞术是２０世纪７０年代发展起来的一种快速对 单细胞进行定量分析和分选的新技术 。如测量细胞的物理 或化学性质,如大小、内部结构、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质、 抗原等,并可对其分类收集。 流式细胞仪结合了三大体系：流体力学，光学，及电子 学。随着单克隆抗体技术、荧光染料技术等多学科新技术高 度发展,它在生物医学领域的应用越来越广泛。 流式细胞仪原理 DOT PLOT 流式细胞仪原理 光的散射信号在流式细胞仪是非常有价值的信息： FSC(前向散射光或小角度散射)：细胞相对大小； SSC(侧向散射光或大角散射)：细胞颗粒度及内部精细结构的特性； FL1,FL2,FL3,FL4,等：不同的荧光波段。 散射光和荧光信号接收后经Ａ／Ｄ转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可同时测定一个细胞上的多种不同的特征,如细胞大小、ＤＮＡ含量、细胞表面抗原表达、癌基因蛋白等等。 流式细胞仪的应用 　 免疫学中的应用 常用于免疫细胞的分类、分型,而且还能再进一步区分各系的亚群。例如用抗ＣＤ4、ＣＤ8、ＣＤ3、ＣＤ56、ＣＤ16的单克隆抗体可以将Ｔ淋巴细胞分为Ｔ辅助细胞亚群，Ｔ抑制细胞亚群，并区分出自然杀伤细胞(ＮＫ)，然后通过对ＴＨ、ＴＳ和ＮＫ细胞水平的测定，检测机体的免疫状态。 血液学中的应用 对恶性血液病尤其是白血病可进行分类，另外它通过对细胞周期相关的参数与恶性细胞相关表面抗原标志同时测定，可以了解这种细胞的动力学特点和恶性细胞的来源，以期达到个体化化疗的目的。 流式细胞仪的应用 流式细胞仪的应用 肿瘤研究中的应用 流式细胞仪的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃， 用于测定细胞ＤＮＡ含量，分辨率高,精确，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。ＤＮＡ非整倍体的出现是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病的早期阶段不像上皮性肿瘤的癌变或癌变早期具有一定组织上的特征，但应用流式细胞仪可测得正常细胞和异常细胞ＤＮＡ含量的微小差别。 标本来源 血液、尿液、细胞培养液、胸水、腹水、灌洗液、新鲜实体瘤及活检组织标本、石蜡固定标本等。 注意事项 1 细胞数量要求达到一定的数目，一般在105-107 ； 贴壁细胞的收集过程中要注意不能消化过久，以防碎片过多； 细胞固定时要充分打散，以防出现细胞块，堵塞机器喷嘴； 如连续测量多个时间点的样品，可将固定好的样品置于 -20℃，最后一个时间点一起染色上机检测。 第六章 激光扫描共聚焦显微镜 主要内容 激光扫描共聚焦显微镜原理 共聚焦显微镜与普通显微镜的不同 共聚焦显微镜的应用 激光共聚焦显微镜的原理 Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的 探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射 出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在 探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针 孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测 点即共焦