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器皿的包扎和灭菌 高温杀菌 干热灭菌 ①焚烧灭菌法 此法灭菌彻底，迅速简便，但使用范围有限。常用于接种工具、污染物品以及实验动物尸体等废弃物的处理。 ②干热灭菌法160~170℃处理2 h 主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌, 只适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。其优点是可保持物品干燥。 湿热灭菌 ①煮沸消毒法 在水中煮沸15 min以上，可杀死细菌的所有营养细胞和部分芽孢。这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。 ②高压蒸汽灭菌法 √ 是实验室及生产中常用的灭菌方法。加压则可提供高于100℃的蒸汽。加之蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。一般培养基、各种缓冲溶液、玻璃器皿等，常采用1 kg/cm2 (121℃) 处理15~30 min即可达到灭菌的目的。 纯培养技术 微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。 HA和HI试验的实验原理（图示） 二、材料1、生理盐水2、红细胞悬液 采成年鸡的血液，抗凝，用生理盐水洗涤3-5次（每次以3000r/min离心5-10min），将血浆、白细胞等充分洗去，将沉积的红细胞用生理盐水稀释成1%的悬液备用。3、鸡新城疫抗原（收集接种鸡胚的尿囊液）4、鸡新城疫标准阳性血清 三、操作方法（一）血凝试验（HA） 4单位病毒的配制： （二）HI试验的操作步骤 结果判定 * 生物技术专业实践技能竞赛动员会 细胞培养瓶的包扎 吸管的包扎 培养皿的包扎 胶塞的包扎 瓶盖的包扎 盐水瓶的包扎 获得纯培养的方法 稀释倒平板法pour plate method 涂布平板法spread plate method 平板划线分离法streak plate method 1、稀释倒平板法 2、涂布平板法 操作较麻烦，对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！ 使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！ 3、平板划线分离法（Streak Plate） 特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 细菌的革兰氏染色 1.在载玻片上滴一小滴蒸馏水 2.无菌操作取菌 3.涂片 4.烘干 5.固定 6.结晶紫初染1min，水洗 7.碘液媒染1min，水洗 8.95%乙醇脱色至流出液刚好无色，立即水洗 9.复红复染1min，水洗 10.吸干水分 11.镜检（油镜的使用与维护） 血凝和血凝抑制试验 GO 抗体与病毒对应 抗体与病毒不对应 v v v v RBC RBC 红细胞凝集（血凝现象） 红细胞不凝集 （血凝抑制现象） 抗体 （抗原与抗体的结合具有很强的特异性） RBC v v v v v RBC RBC RBC RBC RBC RBC v RBC RBC RBC 血凝性病毒 血凝素 RBC 有其受体的红细胞 血凝素的受体 在微量血凝板上，在期中一排的每孔加入50μL生理盐水。 在每排的第1孔加入被检抗原50μL ，混匀后吸取50μL至下一孔，一直到第11孔，并吸弃50μL病毒悬液。 每孔加入1%鸡红细胞悬液50μL，第12孔为不加病毒的红细胞对照孔，立即振荡混匀。 室温静置15min后开始观察结果。 结果判定。以使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释度作为该病毒的红细胞凝集价（HA价）。 21 2 2 23 24 25 26 27 28 29 210 211 对照 HA试验 做HA试验，读出新城疫病毒的血凝价 4V的稀释倍数 21 2 2 23 24 25 26 27 28 29 210 211 对照 HA试验 病毒液 生理盐水 四单位病毒 1 ml + 63ml → 64ml 0.1 ml 6.3ml 6.4ml 根据待检血清份数估算的4单位病毒的需要量 分别量取病毒液和生理盐水注入烧杯，混匀。 一块板按5ml算即可。为方便量取，若只一块板可配6.4ml;两块板可配12.8ml。 Back 如配制6.4ml4V，则吸0.1ml病毒液,吸6.3ml生理盐水。 例如28 28-2（64） 振荡15～30s，置37℃温箱中作用15～30min观察结果 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1%鸡RBC悬 液