PCR nzymes 的选用.ppt

* 宝生物工程（大连）有限公司, 116600 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. PCR Enzymes 的选用 (PCR: Polymerase Chain Reaction) PCR 法原理 Step 1：双链DNA热变 性（94℃）； Step 2：引物与模板单链DNA退火（55℃）； Step 3：DNA的聚合延 伸反应（72℃）； Step 4：扩增的双链DNA再次热变性（返回 Step 1）。 （Step 1～3 称为一个循环，如此循环往复25～30次） PCR 反应五要素 ● 模板DNA ● PCR用引物 ● PCR用DNA聚合酶 ● PCR用Buffer ● dNTP PCR 反应存在问题 1. 可信度（Fidelity）： PCR反应过程中的错配（Misincorporation）现象，给克 隆、变异导入带来麻烦。 2. PCR扩增的特异性： 非特异性扩增往往给实验带来麻烦。 3. 扩增的DNA长度： 一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。 4. 扩增的DNA量： 对有些检测、克隆实验，DNA量往往达不到要求。 5. PCR扩增困难： 当DNA富含GC或具有复杂二级结构时， PCR扩增困难。 6. PCR反应速度： 当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。 ● LA PCR 技术 ●LA PCR (Long and Accurate PCR）技术的关键是使用具有3’→5’ Exonuclease活性（Proof reading活性）的耐热性DNA聚 合酶。原理见右图。 ● Hot Start PCR 技术 ●第一步PCR反应的升温期（----部分），控制DNA聚合酶使其不发生作用。 抗体作用原理图 Taq 酶 抗Taq 酶抗体 抗原抗体结合 Taq 酶活性恢复 94℃加热，抗体失活 ● Hot Start PCR 技术 ● Real Time PCR 技术 Forward Primer Reverse Primer 荧光发光 报告基团 淬灭基团 DNA模板 DNA模板 荧光淬灭 PCR扩增时，荧光探针分解， 荧光发光 Taq Polymerase (5’→3’ Exonuclease) (TaqMan探针法) TaKaRa PCR Enzymes 种类 1.TaKaRa TaqTM TaKaRa TaqTM Hot Start Version 2.TaKaRa Ex TaqTM TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version TaKaRa Ex TaqTM R-PCR Version 3.TaKaRa LA TaqTM 4.Pyrobest TM DNA Polymerase 5.TaKaRa Z-TaqTM TaKaRa TaqTM ●特点 1. 进行1～2 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 比较经济的PCR用DNA聚合酶。 3. 适用于一般的PCR扩增或检测。 ●特点 1. 进行1～2 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 适用于一般的PCR扩增或检测。 3. 进行Hot Start法PCR扩增，增加PCR扩增的 特异性。 TaKaRa TaqTM Hot Start Version TaKaRa TaqTM 扩增例 扩 增 例 TaKaRa TaqTM Hot Start Version 1. TaKaRa Taq 2. TaKaRa Taq 3. TaKaRa Taq HS Ver. 4. TaKaRa Taq HS Ver. M. 100 bp Ladder Marker TaKaRa Ex TaqTM ●特点 1. 进行15 kbp以下的DNA片段的PCR扩增。 2. 融合了LA PCR技术。 3. 保真性是TaKaRa TaqTM 的3～4倍。 4. 从扩增灵敏度、扩增量、PCR条件的通用性考 虑，是一种多用型的PCR用DNA聚合酶。 5. Hot Start Version可进行Hot Start法PCR扩增，增加PCR扩增的特异性。 TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version TaKaRa Ex TaqTM 扩增例 扩 增 例 TaKaRa EX TaqTM Hot Start Version 1. TaKaRa EX Taq 2. TaKaRa EX Taq 3. TaKaRa EX Taq HS Ver. 4. TaKaRa EX Taq HS Ver. M. 100 bp Ladder Marker ●特点 融合了LA PCR技术，增强了 PCR扩增