应用四环素调控系统研究TGF1定量表达课件.ppt

应用四环素表达系统上调内源性TGF-β1表达对HL-60细胞增殖、分化及凋亡的影响　研究生：杨大柳　导师：陈元仲 　 前　　 　　言 　　　TGF-β1是迄今为止了解的功能最复杂的细胞因子之一，目前已知的功能主要有调节细胞生长和分化，诱导细胞凋亡，影响细胞粘连和细胞迁移，调节胚胎发育过程，促进细胞外基质的形成，促进创伤愈合，参与对免疫抑制及对炎症反应的调节等。近年来的研究表明TGF-β及其受体与肿瘤的发生、发展密切相关。 　　 TGF-β1是目前所知最强的血细胞增殖抑制因子，在造血细胞生长、增殖、分化及凋亡中起重要作用 。　 　　　本课题组前期研究发现，从早期造血干细胞、单个核细胞到终末期细胞如分化成熟的粒细胞及血小板均表达TGF-β1，提示内源性TGF-β1是促进血细胞的分化、调亡的内在动力，进一步研究发现采用全反式维甲酸（ATRA）及AS2O3诱导HL－60细胞分化、凋亡过程中伴有内源性TGF-β1 mRNA表达上调、bcl-2表达下调，将p53基因导入HL-60、K562细胞，发现p53 基因在诱导 HL-60、K562 细胞凋亡的早期，内源性 TGF-β1 mRNA 表达上调，且细胞分泌 TGF-β1蛋白的水平有明显提高，为了证实上述假说，我们应用TGF-β1反义siRNA ODNS抑制内源性HL-60细胞TGF-β1表达，发现其能阻断ATRA及AS2O3诱导细胞分化与凋亡，同时伴bcl-2表达恢复。 　　　我们前期研究还发现急性白血病患者血清中TGF-β1水平明显减低，经治疗获缓解后其水平恢复正常，复发患者TGF-β1水平又降低，急性白血病原代细胞和细胞株培养上清TGF-β1水平与正常细胞相比有明显下降。进一步将外源性猪TGF-β1基因转染HL-60细胞，也证实可以抑制HL-60细胞增殖、诱导细胞凋亡，提示内源性TGF-β1表达缺陷可能是导致白血病细胞凋亡受阻、过度增殖的原因。 以上研究不足： 1、外源性TGF-β1因子 2、猪全长TGF-β1基因 3、瞬时转染 　　　四环素调控系统是目前应用最为普遍的人工表达调控系统之一，该系统由三部分组成:转录调节子、四环素反应性启动子和四环素及其衍生物。转录调节子由大肠杆菌Tn10转座子的抗四环素操纵子的阻遏蛋白( tetR)和转录活化蛋白(TA)或抑制蛋白 (TS)两部分组成;四环素反应性启动子包括可以和tetR结合的七个拷贝的操纵子序列及其下游的TATA盒、转录起始点三部分，最常用的启动子来自人巨细胞病毒即刻/早期启动子，四环素及其衍生物可以和TetR结合，应用于人和动物副作用较小，而且能够穿过胎盘屏障和血脑屏障，由于它的亲脂性，可以被动穿过真核细胞膜发挥作用。 一、含人全长TGF -β1 cDNA真核表达载体pcDNA4- TGF-β1的构建及　其双稳定转染HL-60细胞的筛选 二、TGF-β1基因修饰的HL-60细胞生物学特性研究 三、TGF-β1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究 第一部份 　 　含人全长TGF -β1 cDNA真核表达载体pcDNA4- TGF-β1的构建及其双稳定转染HL-60细胞的筛选 材 料 与 方 法 　 　　　　实验材料 1、pcDNA3- TGF -β1真核表达载体由复旦大学张农教授馈赠，来自pSP65- TGF -β1(源于德国Dr,Odenthal博士)。 2、其余实验材料分别购自： Invitrogen公司、 TaKaRa公司、 QIAGEN 公司、 Promega公司等生物试剂公司。　 细胞株及培养条件 　HL-60细胞为急性粒细胞白血病细胞株，为本研究所保藏，HL-60细胞培养于含10％FBS的RPMI1640培养液中，在37℃，5％CO2,饱和湿度条件下的CO2培养箱中培养。 　 重组真核表达载体pcDNA4- TGF-β1的构建 重组质粒的鉴定 　　1、阳性菌落的PCR 鉴定 　　2、重组质粒的酶切鉴定 　　3、重组质粒的测序 质粒转染及筛选实验方法 确定HL-60对Blasticidin及Zeocin的敏感性 1、用含不同浓度的Blasticidin或Zeocin培养基 　 2、每天观察细胞，每三天用含不同浓度Blasticidin及Zeocin培养液的更换培养液一次。 3、以四孔细胞全部死亡的Blasticidin及Zeocin最低稀释浓度为筛选浓度。 细胞转染 1、 pcDNA6/TR质粒转染HL-60细胞并筛选抗性细胞克隆TREx-HL-60。 2、pcDNA4－TGF-β1质粒转染TREx-HL-60细胞并筛选抗性细胞克隆。 转染效率的测定 　荧光表达的pIRES2-EGFP空载体转染后24h，调整细胞浓度，加细胞悬液于细胞计数板，荧