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一种简单高效水稻体细胞诱变育种新方法 　　摘要：多样化种质资源的利用对于培育高产和理想农艺性状水稻品种显得非常重要.在本研究中，通过研究继代时间、2，4D浓度和不同外植体对诱变和分化频率的影响，建立了幼穗为外植体、继代培养时间为3个周期（约75 d）以及2，4D的最佳诱变浓度为4.0 mg/L的体细胞诱变育种方法.然后利用该方法诱变杂交水稻亲本株1S和中9B，分别成功选育了优良矮化突变株系SV14S和SV9B，为后续的杂交育种提供了优质种质资源.这些育种成果的取得进一步证实了该水稻体细胞诱变育种方法是一种简单高效的新型育种方法. 　　关键词：突变；水稻（Oryza sativa L.）； 组织培养； 2，4D； 育种 　　中图分类号：S336 文献标识码：A 　　水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的经济谷类作物，有超过一半的世界人口以大米作为主食.然而，随着人口的不断增长和耕地的减少，据估计到2030年大米的需求将比现在提高40%[1].因此，很有必要通过各种育种方法以提高水稻产量. 　　育种是一个从大量株系中筛选出理想表型株系的过程，这些大量的株系一般来源于自然和人工突变以及杂交重组.因突变可能产生的优良种质是育种的一个重要来源.多样化的种质资源对水稻育种非常重要，如提高产量以及其他农艺性状的改良等[2-3].然而，优良品种的筛选需要大量原始育种材料，因而采用新的方法来获得大量多样化的候选株系就显得非常重要.体细胞无性系变异作为一个新的变异来源，引起了遗传学家和育种学家的大量关注[4].许多作物包括玉米和水稻[5]等已被用于组织培养和体细胞无性系变异研究[5-7]，为作物育种提供了一种新的诱变途径.体细胞的诱导突变能够获得相当丰富的遗传变异，又因其容易应用和推广而具有很高的实用价值[8-9].突变体因染色体数目改变、点突变、结构性染色体重排等原因而引起表型改变，而且该表型还可以稳定遗传.因此，以此为基础可以培育新的作物优良品种. 　　体外培养诱导突变所涉及的因素包括培养基的成分（各种盐类、激素和有机物质等）和培养条件（温度、光照和培养时间等）[10].诱变造成组织培养细胞的突变可能是一个或多个诱变因素.迄今，在水稻诱变育种??面还未见以高浓度2，4D为诱变剂的诱变育种方法的报道.在本研究中，我们分别研究了继代培养时间、2，4D浓度和不同外植体对突变频率的影响，建立了一种以幼穗为外植体和4.0 mg/ L 2，4D诱变处理的水稻体细胞无性系诱变育种方法.同时，利用该诱变方法从水稻品种株1S和中9B中分别成功选育了2个稳定的优良矮秆突变株系SV14S 和 SV9B，并进一步证实了该水稻体细胞诱变育种方法的有效性. 　　1材料与方法 　　1.1实验材料 　　本研究所用的植物材料为4个籼稻品种株1S，中9B，316B和R527，均为华南地区的杂交水稻骨干亲本.株1S为湖南省株州市农科所培育的籼型光温敏核不育水稻 [11]，中9B和316B是优良三系保持系，而R527是一种优良的恢复系. 　　株1S用于进行各种诱变因素的优化实验.当最优诱变体系建立后，中9B，316B和R527用于后续的诱变育种实验，用以对该诱变方法加以验证. 　　1.2实验方法 　　1.2.1培养基和培养条件 　　选用MS为基本培养基[12]，蔗糖浓度为3.0%，用0.8%的琼脂或0.4%植物凝集素固化，pH为5.8～6.0，在121 ℃湿热高压灭菌20 min，不同发育阶段添加不同的激素（见表1）.培养温度为25±1 ℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为12 h光照/12 h黑暗. 　　1.2.2外植体的获取和愈伤组织的诱导 　　幼穗采集自水稻花粉母细胞形成时期，约2～3 cm长，与外面包裹的2层叶鞘一并采集.采集的幼穗可以在4 ℃冰箱中保存7 d.将幼穗外层叶片剥去，保留旗叶鞘，置于70%酒精中浸泡1 min，再置于10% NaClO中表面消毒10 min.于超净工作台用无菌水冲洗4～5次，除去包裹着的旗叶鞘，将幼穗切成1 cm左右的小段，接种于诱导培养基中以获得愈伤组织（图1（a））.幼胚采集自水稻受精后10～15 d的幼嫩种子，其表面消毒过程与幼穗一样.于超净工作台用镊子将幼胚从颖壳内挤压出来，然后接种在诱导培养基中以获得愈伤组织.成熟胚来自除去颖壳的成熟种子，其表面消毒过程与幼穗一样.最后将除去颖壳的成熟种子接种于诱导培养基中以获得愈伤组织. 　　1.2.3继代时间对植株再生的影响 　　选取由株1S幼穗经过21 d诱导培养所得的新鲜愈伤组织，接种于继代培养基中进行继代培养.以25 d为一个继代培养周期，将愈伤组织分别继代培养1～9个周期.然后将经过不同时间继代培养的愈伤组织转移至分化培养基中进行分化