分子生物学实基本技术.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 凝胶电泳 　　 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。 琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等。应用较广，介绍如下： 等电点：DNA pI=6.0-7.0 支持介质：琼脂糖、PA 分离范围：agarose：100bp～60kb PA：5～500bp F=q × E F’= 6πrην F= F’, ν=q?E/ (6πrη) 泳动率（电泳迁移率）：单位电场强度的泳动速度 U= ν /E =q / (6 π rη) =(d/t)/(V/L) （cm2/V ? S） 迁移率单位：10-5 （cm2/V ? S） 球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。 电泳影响因素 1. 样品DNA物理性质 质粒构象： CC＞L ＞OC 线形：㏒10M正比1/U (U:泳动率） 2. 介质性质 ㏒10U= ㏒10U0-KrT U：泳动率；U0：自由泳动率；Kr：介质阻滞系数； T：凝胶浓度。 3. 电压：5v/cm, 电场强度：V/L 4. 缓冲液 离子强度：0.02～0.2 (I＝(ΣCZn)/2） C：溶液mol浓度；Z：化合价；n：原子数目。 TAE、TBE、TPE 5.电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。 如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度 线形DNA的最佳分辨范围（bp） 0.5% 1,000～30,000 0.7% 800 ～12,000 1.0% 500 ～10,000 1.2% 400 ～7,000 1.5% 200 ～3,000 2.0% 50 ～2,000 DNA片段长度 Agarose浓度使用 Marker种类 200 bp以下 3%以上 DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 200 bp～700bp 2%～3% DNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 700 bp～1,500 bp 1%～2% λ-EcoT14 I digestDNA Marker DL2,000DNA Marker DL2,000 + 15,000100 bp DNA Ladder Marker 1,500 bp～5,000 bp 0.7%～1% λ-EcoT14 I digestλHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 5,000 bp以上 0.7%以下 λ-EcoT14 I digestλHind III digestDNA Marker DL15,000DNA Marker DL2,000 + 15,000 四、 核酸定量技术 原理 A=㏒10（1/T）=-log(I/I0)=abc a：消光系数、c：物质浓度、b：介质长度 浓度： dsDNA: 1A260=0.05ug/ul ssDNA和RNA: 1A260=0.04ug/ul 引物: 1A260≈0.033ug/ul