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竞争化学发光酶免疫分析检测血清透明质酸方法建立 　　[摘要] 目的 建立人血清透明质酸（HA）化学发光酶免疫定量检测分析方法。 方法 以偶联了牛血清白蛋白的透明质酸包被，以辣根过氧化物酶标记透明质酸结合蛋白（HABP），以过氧化氢（H2O2）-鲁米诺（luminol）化学发光体系作为检测体系，采用竞争法的反应模式，优化筛选温育条件、抗体包被条件、酶标记物稀释度和发光反应时间等条件。同时进行回收实验、热稳定性等实验，并随机选取60例肝纤维化患者血清与进口试剂进行比对实验。 结果 所建立方法的检出限为6.12 μg/L，批内和批间变异均小于10%。检测HA的临床高、中、低值血清回收率为分别为93.5%、95.6%和101.2%；在4℃和37℃条件下分别进行了3、5、7 d的稳定性考察，线性相关系数均 0.98， 标准偏差 0.05）。 结论 成功建立定量HA微孔板化学发光酶免疫分析方法，该方法具有较高的准确性、灵敏度及良好的重复性，并与进口试剂检测结果一致。 　　[关键词] 透明质酸；竞争化学发光酶免疫分析；肝纤维化 　　[中图分类号] O657 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0162-03 　　透明质酸（hyaluronic acid，HA），又称玻璃酸、玻尿酸（hyaluronic acid， HA），是一种独特的线性大分子黏多糖，分子式为（C14H21NO11） n。通常将玻璃酸及其反离子所生成的离子对或盐统称为HA[1-2]。HA是肝脏细胞外基质中蛋白多糖的一个组成成分，它由肝内间质细胞合成，内皮细胞摄取降解少量小分子亦由肾小球滤过。HA在血清中的含量对判断肝病的严重程度、鉴别有无肝硬化及预测肝病预后均有一定意义[3-5]。因此，血清HA检测已被单独或与其他标志物检测共同作为非侵入肝纤维化检测指标[6]。 　　化学发光免疫分析法（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）较既往的放射免疫分析法和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法具有无放射性污染、灵敏度高、特异性强、操作快速简便及易于自动化等优点，已广泛用于临床免疫检测中[7]。本研究采用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，通过对各种免疫反应条件的优化建立了竞争法人血清HA的CLEIA，并对其进行了方法学评价。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　随机选取60例解放军第三○二医院院确诊为肝纤维化患者的检测剩余血清，其中，男38例，女22例，年龄23～70岁，所有血清标本分离后于-80℃冻存。 　　1.2 仪器 　　化学发光检测仪为北京滨松光子技术有限公司BHP9507型，酶标仪为美国Thermo Labsystems MK3型。 　　1.3 试剂 　　人HA ELISA检测试剂盒购自美国RB（Rapidbio））公司，HA、牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）、鲁米诺、HRP、透明质酸结合蛋白（hyaluronic acid binding protein， HABP）及其单抗购自美国Sigma公司，其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司。 　　1.4 方法 　　1.4.1 HA和BSA的偶联 应用改良后方法[8-9]，偶联HA和BSA，制备透明质酸牛血清白蛋白（HA-BSA）用于包被，并保持其水溶性。 　　1.4.2 HABP的标记 应用改良过的碘酸盐氧化法[10]，用HRP对HABP单克隆抗体进行标记， 并保持单抗的免疫反应活性和酶的催化活性。 　　1.4.3 竞争法HA CLEIA检测方法的建立 经过抗体的包被、封闭、加HABP和待测样本或标准品、洗板、加二抗、洗板、加底物、上机读数等一系列步骤完成检测方法的建立，反应条件、标准品及反应液配制根据参考文献[11]介绍方法进行调整优化。 　　1.4.4 HA CLEIA检测方法的性能评估 按参考文献[11]所述方法，对检测方法的标准曲线与灵敏度、特异性、精密度、准确性、健全性、稳定性进行评估。 　　1.4.5 比对实验 对60例肝纤维化患者血清，应用CLEIA和ELISA方法同时进行检测，并对其相关性进行统计分析。 　　1.5 统计学方法 　　应用SPSS 13.0软件对所有数据进行统计分析。标准曲线绘制采用双对数回归法；灵敏度通过测定10个标准品零点（S0）浓度对应发光强度值，求出均值和标准偏差（standard deviation， SD），均值加2倍SD， 代入线性方程， 所得浓度即为灵敏度；精密度计算是对低、中、高两种不同浓度的质控血清，分别进行8孔平行测定，计算批内变异，将此操