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高致龋性变异链球菌临床分离株初步筛选 　　[摘要] 目的 初步筛选高致龋性变异链球菌临床分离株。方法 通过检测41株变异链球菌临床分离株的产酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成细胞外多糖能力，初步筛选出高致龋性变异链球菌临床分离株。结果 不同的变异链球菌临床分离株体外致龋能力不同，其中3株产酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成细胞外多糖能力均较高，提示可能为高致龋性变异链球菌临床分离株，另外3株产酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成细胞外多糖能力均较低，提示可能为低致龋性变异链球菌临床分离株。结论 通过筛选可能获得了高致龋性变异链球菌临床分离株。 　　[关键词] 变异链球菌； 产酸； 耐酸； 黏附； 细胞外多糖； 筛选 　　[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.006 　　变异链球菌是人类口腔中的主要致龋菌。研究[1]表明：从高龋患者口腔中分离获得的变异链球菌临床分离株比从无龋健康人口腔中获得的分离株具有更强的致龋能力，更易诱发龋病；也有研究[2]证实， 　　不同龋指数患者口腔中的变异链球菌的体外致龋能力是不同的，提示不同个体龋易感性的差异可能与口腔中变异链球菌不同毒力株的致龋能力不同有关。从临床上分离鉴定的变异链球菌临床分离株中筛选出具有较高致龋能力的菌株，对于研究龋病的发病机理是非常必要的。在以前的研究[3]中，本课题组从临床上分离鉴定出41株变异链球菌临床分离株，本研究在此基础上，通过检测变异链球菌临床分离株的黏附能力、合成细胞外多糖的能力、产酸能力和耐酸能力，对变异链球菌临床分离株的致龋特性进行分析，希望从41株变异链球菌临床分离株中筛选出高致龋性变异链球菌株。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验菌株 　　变异链球菌国际参考菌株Ingbritt（首都医科大学 　　附属北京口腔医院口腔医学研究所）；41株变异链球菌临床分离株[3]（从临床上分离获得，41株菌株已通过基因分型鉴定为不同基因型，其中1～10号菌株来源于无龋健康人，11～41号菌株来源于高龋患者）。 　　1.2 菌悬液的制备 　　将-70 ℃冻存的变异链球菌临床分离株41株及国际参考菌株Ingbritt复苏，接种??脑心浸液（brain-heart infusion，BHI）培养基中，37 ℃厌氧条件下培养24 h；再分别取各菌株的培养物100 μL，转种于20 mL BHI培养基中，37 ℃厌氧条件下培养至对数生长晚期（OD600约为0.5）。将42株菌株的培养物分别于4 ℃、3 000 r·min-1离心15 min，弃上清液，收集细菌沉淀物，无菌中性PBS缓冲液洗菌2次，并重悬成菌悬液，细菌密度约为5×108 CFU·mL-1。 　　1.3 黏附实验[4-5] 　　1.3.1 唾液包被羟磷灰石（saliva-coated hydroxy- 　　apatite，SHA）的制备 取一健康成人进食2 h后的非 　　刺激性全唾液，冰浴，于4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，收集上清液，60 ℃水浴30 min以灭活蛋白酶，并用直径为0.45 μm的无菌针头式过滤器过滤以去除细菌和杂质，-20 ℃储存备用。 　　在分析天平上准确称取羟磷灰石颗粒4 mg，置于1.5 mL Eppendorf管中，高压灭菌；每管中加入已高压灭菌的黏附缓冲液200 μL（KCl 50 mmol·L-1、 　　KH2PO4 1 mmol·L-1、CaCl2 1 mmol·L-1、MgCl2 　　0.1 mmol·L-1，溶解于蒸馏水并调pH值至6.8后定容至200 mL），37 ℃水浴平衡过夜；然后吸去黏附缓冲液，每管加入已制备好的唾液100 μL，37 ℃、6 r·min-1旋转2 h，然后吸去唾液，用200 μL黏附缓冲液洗涤2次后，加入100 μL含5 g·L-1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的黏附缓冲液，37 ℃、6 r·min-1旋转30 min，吸去液体，再用黏附缓冲液洗涤3次，即制备成SHA。 　　1.3.2 SHA黏附实验 分别取各变异链球菌临床分离株和国际参考菌株的菌悬液100 μL加入到含有4 mg SHA的Eppendorf管中，在37 ℃厌氧条件下，6 r·min-1旋转90 min；吸去菌液，用500 μL黏附缓冲液洗涤3次以去除未黏附的菌体细胞；吸去液体，每管加入200 μL无菌中性PBS缓冲液和无菌玻璃珠，用旋涡振荡器振荡混匀120 s，将已黏附至SHA上的菌体细胞从其上脱离下来并悬浮于中性PBS缓冲液中，即为原液。将原液用中性PBS缓冲液做10倍系列稀释，取10-2和10-3稀释液各100 μL，分别接种于轻