糖基化终产物对小鼠腹腔巨噬细胞活化与MMP9_活性的影响以及辛伐他汀的作用课件.ppt

* 糖基化终产物对小鼠腹腔巨噬细胞活化与MMP-9 活性的影响以及辛伐他汀的作用 中国医科大学实验病理学教研室 李永军　杨向红等 前言 糖尿病人易患动脉粥样硬化，而且糖尿病性动脉粥样硬化在晚期往往具有不稳定斑块的特点：纤维帽薄，脂质核心大，炎性细胞多，易破裂。 动脉粥样硬化斑块处的巨噬细胞可分泌多种基质金属蛋白酶类，参与斑块破裂的过程。而且，基质金属蛋白酶的分泌是巨噬细胞活化的证据。 MMP-9 activity ? Macrophage activation Plaque rupture Monocyte recruitment 糖尿病性动脉粥样硬化斑块另一个特征是在斑块处有大量的糖基化终产物的沉积。 Nakamura Y, Horii Y, Nishino T, Shiiki H et al. Immunohistochemical localization of (AGEs) in coronary atheroma in diabetes. Am J Pathol 1993; 143: 1649-56. 糖基化终产物 氧化型低密度脂蛋白 胶原纤维 红细胞 血小板 内皮细胞 平滑肌细胞 巨噬细胞 有研究表明：糖基化终产物多分布于富含巨噬细胞的纤维帽肩区 ，与斑块不稳定呈正相关。但是，其机制有待进一步研究。 不稳定动脉粥样硬化斑块 实验目的 本实验通过观察糖基化终产物作用后的巨噬细胞的形态变化并测定MMP-9活性改变，来研究糖基化终产物对巨噬细胞活化及其与斑块破裂的关系，并初步探讨辛伐他汀是否可以通过抑制基质金属蛋白酶来发挥其稳定斑块的作用。 糖基化终产物 MMP-9 活性? 巨噬细胞 辛伐他汀 巨噬细胞活化 实验方法 糖基化牛血清白蛋白的制备与检测 将小牛血清白蛋白20g/L与500mmol/L葡萄糖溶于pH7.4、0.2mmol/L磷酸盐缓冲液中，混匀、室温过夜放置。过滤除菌后，避光孵育3个月。糖基化白蛋白的检测采用荧光分光光度法，测定其荧光值(激发波长370nm,狭缝3nm，发射波长440nm,狭缝3nm)。 小鼠腹腔巨噬细胞培养 采用小鼠腹腔取材法分离细胞，加入含无血清的RPMI 1640 培养基,以2×106 个细胞/培养皿的浓度置于 37 ℃、5 % CO2 培养箱培养。 第一组实验为对照组与AGE-BSA作用组（400mg/l）, 作用48小时，然后进行细胞形态观察。 实验分组 -1 第二组实验为不同浓度AGE-BSA作用组（0、50、100、200、400 mg/l），作用48小时。 第三组实验为相同浓度AGE-BSA（400 mg/l）不同作用时间组（0、12、24、36、48小时）。 实验分组 -2 第四组实验为对照组、辛伐他汀组、AGE-BSA（400 mg/l）组、 AGE-BSA（400 mg/l）+辛伐他汀（0.5μmol/ml）组、 AGE-BSA（400 mg/l）+辛伐他汀（5.0 μmol/ml）组,作用48小时。 在第二组实验至第四组实验中，收集培养液，3000rpm离心30分钟，提取上清。 实验分组 -3 明胶酶谱法测定MMP-9 活性 在实验组与对照组中，取培养细胞上清液与等体积的上样缓冲液混匀，上样于分离胶中，140V电泳70min。将胶浸泡于Triton X-100中温和振荡洗涤120min, 再浸泡于复性液中孵育18h,考马斯亮蓝染色, 用脱色液脱色,观察。并使用Fluorchem Imaging System 对实验结果进行扫描分析。 统计学分析 实验结果应用microsoft excel进行统计分析和处理。P0.05为有统计学意义。 实验结果 1. 糖基化牛血清白蛋白的检测结果 300 350 400 450 500 550 600 10 20 30 40 50 60 70 80 0 光度值 波长 2、AGE-BSA可活化小鼠腹腔巨噬细胞。 与对照组相比，糖基化终产物可在体外活化小鼠腹腔巨噬细胞，细胞明显增大，伸出伪足（×200）。 3、随着AGE-BSA浓度逐渐增加和作用时间逐渐延长，MMP-9 活性也随之增加，呈剂量及时间依赖效应 400 mg/l 200 100 50 0 AGE-BSA （48h) 0 50 100 200 400 400 300 100 200 0 ** ** ** ** 92kDa 48h 36h 24h 12h 0 AGE-BSA （400 mg/L) 0 12h 24h 36h