蓝白斑筛选法课件.ppt

蓝白斑筛选法 蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验） IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，是一种乳糖类似物，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的启动子,产生β-半乳糖苷酶。 LacZ基因：编码半乳糖苷酶的基因，能够表达检测剂 。 X-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。  β-半乳糖苷酶可使X-Gal变蓝色。 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。 植入含有一段称为lacz‘的基因的载体。 α-互补 虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz‘的质粒后，质粒lacz’基因编码的α肽链和菌株基因组表达的有缺陷的β-半乳糖苷酶发生了突变互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。 以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片断）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出： 未转化的菌不具有抗性，不生长； 转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 红白斑筛选 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，麦康凯平板中的显色剂（中性红）显红色。因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 * * 蓝白筛选原理 蓝白筛选是在指示培养基上，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。 实验材料介绍 1）载体质粒和转化受体菌株： 实验所使用的载体质粒为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。 E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。 载体质粒 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。(这个编码区中插入了一个多克隆位点) 在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。 菌体中含有带lacz‘的质粒后，质粒lacz’基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力。 lacz中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性 。 实验干扰 在实际操作中,蓝白筛选可能出现浅蓝色重组子， 原因是：插入小片段时，质粒仍可以表达，但形成活力有缺陷的半乳糖苷酶 重组子形成浅蓝斑。 * *