第七章 抗体的标记PPT课件.ppt

氯胺T(ch-T)法 使用无还原剂的高比放射性碘源 ch-T用量要低 控制总反应体积200μl 反应时间1分钟～2分钟 弱碱性反应条件 二、放射性核素标记结合物的纯化 标记反应后形成的结合物不能直接使用，需去除游离125I和其他杂质。 游离125I和125I标记抗体（抗原）分子大小相差悬殊，采用凝胶层析即可分离，如葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）柱层析。 125I结合物纯化 凝胶过滤法 离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法 去除游离125I 去除过度标记的标记物 三、放射性核素标记结合物的鉴定 放射性核素结合物的鉴定包括放射化学纯度、比放射活性和免疫活性三个参数： 放射化学纯度指在标记物中结合在抗原（或抗体）上的放射活性占该标记物总放射活性的百分比。 比放射活性是指单位质量标记物中所含的放射性强度，也可理解为每分子抗原（或抗体）平均所结合放射性原子数目，常用Ci/g或Ci/mmol表示。 免疫活性指标记物与抗原或抗体反应的能力。免疫活性测定方法，用少量标记物与过量抗体反应，测定与抗体结合部分（B）的放射活性，并计算与加入的标记物总放射活性（T）的百分比（B/T）。 125I结合物鉴定 标记物质量 高纯度 高比放射活性 完整免疫活性 放射化学纯度 单位标记物中结合于抗原或抗体上的放射活性占该标记物总放射性的百分比 应大于95% 免疫活性（immunoreactivity） 标记物与抗原或抗体结合的能力 标记物与过量抗体反应百分比 该值越大, 标记物免疫活性好 四、放射性核素标记结合物的保存 放射性核素标记结合物在2~8℃避光保存。注意放射防护，废弃物须按放射防护条例规定处理。标记物长期贮存后可因脱碘和自身辐射造成蛋白质破坏而形成碎片，同样可以采用上述方法对标记物重新进行纯化。 第四节 荧光素与抗原抗体结合物的制备 一、基本方法 荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型： 酰基氯，由磺酸制备。 异硫氰酸和重氮盐类，这两种通常由相应的胺制备，通过化学键作用于相应的抗原、抗体反应结合。 目前标记方法主要是透析法和搅拌法两种： 以FITC标记抗体（IgG）为例：FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合，形成荧光抗体结合物。 FITC标记结合物制备 荧光素标记抗体的方法 原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。 透析法 二、荧光素标记结合物纯化 抗体标记完成后，还应对标记抗体进行纯化，以除去未结合的游离荧光素，纯化方法可采用透析法和凝胶过滤法。 透析法 将标记的抗体放入透析袋中，不断更换透析液透析1周左右，直至透析液在紫外灯照射下不发出荧光为止，本法适用于蛋白含量低的标记物。 凝胶过滤法 将标记的抗体通过SephadexG25或G50凝胶柱，洗脱第一峰为荧光素标记抗体峰，第二峰为游离荧光素峰，收集第一峰即可。本法简便快捷，可在数小时内完成。 电化学发光剂 酶促反应发光剂 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。 鲁米诺及其衍生物 AMPPD 鲁米诺及其衍生物 鲁米诺发光原理 鲁米诺及其衍生物 鲁米诺增强发光反应原理 AMPPD AMPPD 〔3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕 五、量子点 量子点 QDs 量子点(quantimim dots, QDs)即半导体纳米粒子，是指半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒（1-10nm）。 由II-VI族或III-V族元素组成，性质稳定，可接受激发光产生荧光，具有类似体相晶体的规整原子排布。 广义的量子点还包括 IV-VI 族、V-VI 族元素组成的纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合型荧光纳米颗粒等。 量子点的光学特性 荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强 所谓光漂白是指由光激发引起发光物质分解而使荧光强度降低的现象。有机荧光色素的光漂白速率很快，而量子点的光漂白作用则小得多。 具有“调色”功能，一元激发多元发射 不同粒径的量子点具有不同的颜色，可用同一波长的光激发不同大小的量子点，获得多种标记颜色。 激发光波长宽，而发射光波长窄 量子点的激发光波长范围很宽，具有较大的Stokes位移和狭窄对称的荧光谱峰。 量子点调色功能 在紫外光激发下，相同组成不同粒径的量子点的发射光谱 量子点的制备 大致分为两种方法：物理制备法、化学合成法