实验一 蛋白质的等电点测定和沉淀反应1.pptVIP

实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应 一、目的 1.蛋白质的两性解离性质和等电点 2.学习测定蛋白质等电点的一种方法 3.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 4.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 二、实验原理(一)蛋白质的两性性质和等电点 Pr 为两性电解质，除了含有自由羧基、氨基外，还有酚基(Tyr)、巯基(Cys)、胍基(Arg)、咪唑基(His)等可解离基团-------酸性和碱性基团 pH?pI pH=pI pH?pI 不同的蛋白质有不同的pI 蛋白质 等电点 蛋白质 等电点 胃蛋白酶 1.0 ?-糜蛋白酶 8.3 卵清蛋白 4.6 ?-糜蛋白酶原 9.1 血清蛋白 4.7 核糖核酸酶 9.5 ?-乳球蛋白 5.2 细胞色素C 10.7 胰岛素 5.3 溶菌酶 11.0 血红蛋白 6.7 鱼精蛋白 12.0 等电点沉淀法 静电状态时蛋白颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，易沉淀; 猪胰腺提取胰岛素（ pI=5.30--5.35），可以先调节组织匀浆pH呈碱性，使碱性蛋白沉淀析出，再调节组织匀浆pH 呈酸性，使酸性蛋白沉淀析出，然后调上清液pH至5.3，得到胰岛素粗品。 电泳： 溶液pH值pI，蛋白质带正电荷，向负极移动 溶液pH值? pI，蛋白质带负电荷，向正极移动 电泳方向和速度处决于：电荷种类、电荷数量、蛋白质分子大小和形状 电泳分离血清蛋白-----实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白 蛋白质的胶体性质 MW 1000--1000000道尔顿 颗粒直径1--100nm，具有胶体性质：布朗运动，丁达尔现象，不能透过半透膜，溶胶与凝胶互变，吸附现象等 半透膜分离纯化蛋白质----透析法 半透膜 蛋白质 纯水 蛋白质是一种稳定的亲水胶体 水膜（水化层）：蛋白质分子表面有亲水基团，对水有较大吸引力，分子表面会吸附水（0.4克水/克蛋白质）。水膜使蛋白质颗粒彼此分开，不易聚集而沉淀。 带同种电荷：同性相斥，使蛋白质分子彼此保持一定距离，不易聚集而沉淀。 (二)、蛋白质的沉淀precipitation 实质：破坏水膜或带同种电荷这种状况 与变性后蛋白质沉淀有区别 变性-----构象变化---分子形状改变------分子表面亲水基团减少------疏水基团增加----蛋白质的水溶性下降-----沉淀 但也有例外：在偏酸或偏碱时有时表现为溶解状态 沉淀-----可能变性，也可能不变性，取决于沉淀的方法和条件是否破坏了空间构象。 沉淀蛋白质的方法： 盐析法 有机溶剂沉淀法 生物碱沉淀法 重金属沉淀法 2.有机溶剂沉淀法 能与水互溶的有机溶剂：乙醇，丙酮等 原因：1）有机溶剂的介电常数小于水 丙酮21，乙醇26，水76 蛋白质溶液中加入有机溶剂后，降低了溶剂的极性，削弱了蛋白质与溶剂之间的相互作用，相应的增加了蛋白质颗粒之间的相互作用。 2）破坏水膜，起脱水作用。 有机溶剂与水的亲和力大。 同样可以通过控制混合蛋白质中的有机溶剂浓度，使各种蛋白质先后分别沉淀，从而达到分离目的。 3.生物碱试剂沉淀法生物碱：单宁酸（鞣酸）、苦味酸、磷钼酸、三氯 醋酸等用于去杂蛋白临床用于测定尿液蛋白质含量原因： 三、主要器材四、操作步骤 （一）酪蛋白等电点的测定 1）取同样规格的试管4支，加入各试剂，然后混匀。此时 4个管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.5。 2）各加酪蛋白的醋酸钠溶液1