细菌的简单染色法.pptVIP

细菌的简单染色法 宋国丽 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。 2、初步认识细菌的形态特征。 3、学习训练显微镜及无菌操作技术。 实验目的 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法 适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 ? 常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。 实验原理 ? 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 ? 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 实验原理 (continued) 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型： 1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。 2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。 3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。 4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b)的染料。 1、菌种 枯草芽孢杆菌12～18h培养物 金黄色葡萄球菌24h培养物 大肠杆菌12-18h培养物 2、染色剂 草酸铵结晶紫染液 实验材料 3、其他物品 显微镜、载玻片、香柏油、擦镜纸、接种环、生理 盐水。 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检 无菌操作 操作步骤 菌悬液 涂片 干燥 滴加无菌水 固定 取菌苔 涂片 操作步骤（continued） 1、涂片 取载玻片，滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜，。 如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。 Notes: 1） 载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 操作步骤（continued） 3、固定 目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。 3）增加菌体对染液的结合力，使涂片易着色。 方法： 热固定：涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态 操作步骤（continued） 2、干燥 室温自然干燥 4、染色 ◇ 玻片平放，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。染色1-2min 操作步骤（continued） 5、水洗 倒去染液，自来水轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止。 Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 7、镜检 细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。 操作步骤（continued） 6、干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 Notes: 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头 滴加少量水 挑取菌体 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 附：油镜的使用 双目显微镜 2.油镜的原理 油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。 实验报告 绘图说明所观察到的三种细菌的形态特征。并注明观察时所用的物镜及放大倍数 显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数