组织切片操作流程.doc.doc

切片法主要步骤 1、取材与固 （1）取材：从动物体取下所需的器官材料。取材的动物要健康，材料愈新鲜愈好，应在致死后立即取材，防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄（以不超过0.5cm为宜），不能挤压和损伤。 （2）固定：将所取的材料立即投入固定液中，目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组织块变硬，便于进一步处理。常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。实验室常用Bouin固定液，固定时间为12～24小时，其固定的组织块不需进行水洗，可直接进行脱水。 2、脱水与透明 （1）脱水：固定后的组织块内含有的大量水分要彻底脱去，以便石蜡的浸入。常用的脱水剂为乙醇，脱水过程必须循序渐进，从低浓度开始，逐步升高，使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代。具体操作为：Bouin固定液固定的组织块可直接进入70％的乙醇进行脱水，时间12小时左右。（若材料暂不制片，可保存于70％乙醇中。）然后将组织块依次移入85％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各8-12小时，→95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各2小时，→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各1小时。因无水乙醇对组织有脆化作用，故在无水乙醇中时间不能超过2小时。 （2）透明：由于乙醇与石蜡不能相溶，故浸蜡前要对脱水后的组织块进行透明。常用透明剂有二甲苯、氯仿、苯、香柏油或冬青油等，透明剂能同与乙醇和石蜡相溶，并能增强组织块的折光系数，故透明后的组织块呈半透明状。使用二甲苯作透明剂的透明过程为：将脱水后的组织块放入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）中30分钟，再移入二甲苯中15-20分钟。 3、浸蜡与包埋 （1）浸蜡：将透明后的组织块置于刚过熔点的熔化石蜡中浸渍，使石蜡逐渐渗入并完全置换出透明剂。过程为：先将透明的组织块移入二甲苯与石蜡混合液（1:1）中，在60℃温箱中放置30分钟，再移入熔化的石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）中，在温箱中每级各1小时。 （2）包埋：将浸蜡后的组织块置于盛有熔化石蜡的模具中，并使之凝固成蜡块。 4、切片与贴片 （1）切片：将修整后的蜡块夹在切片机的固定器内，使蜡块的被切面与刀口平行，刀和蜡块成一斜角，以右手摇动摇柄进行切片，切片厚度以5～8um为宜，连续操作可形成蜡带，此时左手持毛笔轻轻取下蜡带，放于盒中。 （2）展片：将切下的蜡片放于温水（约40℃）的表面，使皱褶自然舒展开来。 （3）贴片：借助分离针或镊子，将蜡片贴在洁净载玻片上。贴片后，将切片置于切片架上自然干燥或放入温箱（40℃左右）中烘干。 5、染色与封固 （1）染色：染色后可增加细胞和组织中各结构间色彩的对比以便于观察。切片的染色方法很多，常用的是苏木精（hematoxylin）·伊红(eosin)染色，简称HE染色。染色的具体步骤如下： ①脱蜡：将切片放入二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）中，各置5～10分钟，溶去切片上的石蜡。 ②将脱蜡的切片经各级浓度乙醇（由高到低）下行至水：将从二甲苯（Ⅱ）中取出的切片依次经过：二甲苯与无水乙醇混合液（1:1）→无水乙醇（Ⅰ）→无水乙醇（Ⅱ）→95%乙醇→85％乙醇→70％乙醇各3～5分钟，最后在蒸馏水中浸5分钟，即可进行染色。 ③切片由蒸馏水中转入苏木精染液染色5～10分钟，使细胞内的嗜碱性物质着色。 ④用自来水洗去切片上残余的染液。 ⑤0.5～1％盐酸溶液分色数十秒钟。 ⑥放入自来水中15～20分钟、蓝化。 ⑦置入70％、85％乙醇中各3～5分钟。 ⑧置入伊红染液中染色1～2分钟，使细胞中嗜酸性 物质着色。 ⑨依次进入95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ），各5分钟，以除去切片上水份。 ⑩透明：切片入无水乙醇与二甲苯混合液（1:1）→二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）（Ⅲ），各5分钟。 zzz 常用固定液和染液的配制 Bouin固定液的配制 饱和苦味酸溶液 75份 甲醛 25份 冰醋酸 5份 由于Bouin固定液的各种成分一旦混合，若不立即 使用将会失效，故Bouin固定液只能现配现用。 苏木精染液的配制 （1）Harris苏木精染液 甲液： 苏木素 0.5g 95％乙醇 5.0ml 乙液： 硫酸铝钾（钾明矾） 10g 蒸馏水