深低温冷冻对骨肉瘤体外灭活的正式课件.ppt

四川大学华西医院骨科 肖衡　段宏 屠重棋 前言—液氮冷冻灭活 液氮冷冻灭活在骨肿瘤治疗的应用已有40余年，多采用长时间、多循环的冻融治疗。 Marcove等研究认为，过长时间冷冻和多次冻融周期将严重破坏骨和关节软骨，灭活回植后将不可避免地产生关节退变和关节面塌陷。 为了保证瘤骨液氮灭活后的安全性，探索最优化的冷冻灭活条件具有重要意义。 研究目的 探讨冷冻杀伤骨肉瘤细胞的机理和最佳条件。 为临床更好开展恶性骨肿瘤深低温灭活治疗提供理论依据。 纳入标准 经临床、影像学、病理三结合确诊的骨肉瘤新鲜组织标本。 患者术前均未做过放化疗及其他治疗。 骨肉瘤局部无溃烂及感染等其他病灶。 材料和设备 液氮（－196℃）和金属容器（直径约15cm，高20cm） 深低温温度计（量程－200℃～400℃） 光学显微镜及成像系统（奥林巴斯DP70 ） 透射电子显微镜（日立H-600IV ） 流式细胞仪 （四川大学华西医院提供） 方法 A组（对照组） 结果－冷冻前标本光镜下形态学观察 结果－冷冻前标本光镜下形态学观察 结果－冷冻前标本光镜下形态学观察 结果－冷冻前标本光镜下形态学观察 结果－冷冻前标本电镜下形态学观察 结果－冷冻前标本电镜下形态学观察 结果－冷冻后光镜及电镜形态学观察 结果－冷冻后光镜及电镜形态学观察 结果－冷冻后透射电镜形态学观察 结果－冷冻后光镜及电镜形态学观察 结果－肿瘤细胞变性坏死率计算 肿瘤坏死率评估各组标本，B、C组每个标本切取的病理片随机抽看5个高倍（×400）镜野，计数细胞膜完整、形态结构基本正常的肿瘤细胞记为G；各镜野G细胞数平均值为N。 选取A组肿瘤组织的病理切片，同样随机抽看5个镜野，计数肿瘤细胞为F；各镜野F细胞数平均值为M。 以M和N值可计算坏死率，即:肿瘤细胞坏死率＝(1-N/M)×100％ 结果－肿瘤细胞变性坏死率计算 结果－流式细胞仪检测细胞凋亡 讨论－冷冻灭活的机理 冰晶学说 凋亡机制 免疫学效应 微血管栓塞学说 讨论－冷冻灭活的机理 结合本实验，灭活效应主要来自冰晶造成细胞的坏死和诱发的凋亡。通过计算B组及C组标本肿瘤细胞坏死率和凋亡率，细胞的死亡以坏死为主导，与自身凋亡相结合。 讨论－影响冷冻的因素 冷冻温度在冷冻过程中起关键作用。Kuylenstierna等人要求应用－50℃以下的温度治疗恶性肿瘤。本实验直接将骨肉瘤组织完全浸泡至液氮中，测量温度波动于－184℃ ～ －188℃ ，保证了冷冻温度的要求。 降温速度在冻融灭活过程中起重要作用。Rerte等研究表明只有当温度急剧骤降时，细胞内外同时冻结、形成冰晶所造成的损伤最大。本实验直接将标本浸泡于液氮中，经测量温度迅速下降，符合Baust提出以每分钟100℃的梯度差急速冷冻杀伤细胞的要求。 讨论－影响冷冻的因素 冷冻时间的长短决定冷冻效果。目前国内外多数文献报道冷冻时间在3～10分钟。本实验的时间设定也是根据上述文献而制定，5分钟冻融即可达到效果。 冻融循环次数影响。一般认为二次循环冷冻在确保组织坏死的同时能扩大坏死范围，特别是在冷冻区的周边部分。但本实验，单次与两次冻融的效果无显著差异，可能与取材的大小有关。即单次冻融对大小约1cm×1cm×1cm的组织标本足以达到有效灭活，但对于更大体积范围的组织灭活效果需进一步的研究比较。 结 论 目前认为冷冻灭活的机理有4种学说 离体骨肉瘤组织在液氮浸泡灭活后肿瘤细胞的坏死及凋亡率发生显著提高，灭活效应主要为细胞坏死和凋亡。 液氮（－180℃以下）单次冻融5min以上即可达到灭活效果，两次冻融对细胞结构破坏的程度更严重。 Thank you! 。。。。。。。 可见瘤细胞体积大，核仁占边，瘤巨细胞多见，病理性核分裂较多， 具有典型的梭形细胞，还可见大量的圆形软骨肉瘤样细胞，胞浆色淡，呈透明状： 瘤组织中1/2以上呈纤维肉瘤样结构，瘤细胞呈梭形，束状及紧密编织状排列。 肿瘤由大量血窦构成，血窦有或无内皮，肿瘤细胞有显著多形性和异型性，多核巨细胞浸润，病理性核分裂像多见 图5、6所见瘤细胞外形不规则，呈椭圆型，长梭型或不规则型，核仁明显 。 B组和C组标本冷冻后光镜下观察发现冰晶造成空白区位于肿瘤细胞胞浆内外，见到大量细胞变性坏死：表现为细胞膜破裂，细胞内空化，胞浆溶解；同时有部分骨肉瘤细胞体积缩小，呈现凋亡改变：表现为细胞膜完整，胞质致密、嗜酸性染色增强，核固缩、核碎裂并可形成凋亡小体，其常以分散单个形式存在，与周围细胞分离。 图9所示，细胞胞浆内外大量空泡形成，细胞溶解坏死。图10所示细胞器已经完全溶解消失。 A组为对照组，共10份标本，不做处理 。B组为单次冻融组，为A组同样来源的标本分成4份；分别。。。快速冷冻并快速复温至常温、共