原生质体培养与诱变2012课件.ppt

第六章 原生质体培养与诱变 原生质体培养 原生质体变异 1 原生质体培养 原生质体： 是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的 原生质团。 ◆无细胞壁 ◆具有活细胞的特征 原生质体培养：将细胞去除细胞壁后形成裸露的原生质体，把原生质体放在无菌的人工条件下使其生长发育的技术。 特点： ①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株： 原生质体培养 1.1 原生质体分离纯化 1.1.1 酶解法 一般用植物的体细胞（二倍体细胞）， 采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。 特点： ◆操作简单 ◆分离效果好 ◆细胞基本可保持完整性 分离原生质体主要是酶解法  首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。 由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中须加入0.55mol／L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0.4～0.45mol／L的甘露醇，两者差别较大。 酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。 附：原生质体制备的操作步骤? 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。 花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。下面以多年生大花萱草为例，介绍原生质体的制备和融合方法。 1.取盛开的大花萱草作为实验材料。我们可以看到在每一个花瓣上都具有红、黄、白三种颜色。 花瓣表皮为排列紧密的表皮组织，不易酶解，用尖头镊子撕去表皮。 （A）将暴露的花肉组织浸泡在酶液里。 （B）排列相对疏松的花肉细胞很容易被酶液消化。 2. 在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定。因此要用显微镜随时检查酶解情况。 ?????????????????????????????????????点击观看动画演示 3. 酶解好的原生质体经300目尼龙网过滤到离心管中，除去未消化的大块组织。 4.离心5分钟（500-1000转/分），使悬浮的原生质体下降至离心管底部，缓缓倾倒出上清液。加入培养液，吹打使其悬浮，再离心，重复2次，目的是洗去酶液，使原生质体悬浮在等渗培养基中。 显微镜检查清洗后的原生质体，如碎片过多，则用蔗糖漂浮法去除碎片。 蔗糖漂浮方法：　　细口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。　　　离心5分钟（500转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处。　　用细管轻轻插入底部将沉将在离心管底部的碎片小心吹打，混匀在蔗糖溶液中，连同蔗糖溶液一起小心吸出， 　　再吸去上清液即得到健康的原生质体。 1）离心沉淀法 经酶解处理后得到一个由原生质体、细胞团和细胞碎片组成的混合液，需要进一步纯化。常用的纯化方法有： 离心沉淀法? 是?利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先行过滤再低速离心，使原生质体沉淀于试管底部。该方法比较简单，由于原生质体沉淀在一起相互挤压，常引起原生质体破碎。 1.1.2 原生质体的纯化 经酶液处理的原生质体悬浮液用400目网筛过滤后，滤液经500~1