3酶的离纯化.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 反渗透（Reverse osmosis，RO） 利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。 渗透与反渗透 3. 电场膜分离 （1）电渗析： 在半透膜的两侧分别装上正、负电极。（2）离子交换膜电渗析： 用离子交换膜代替一般的半透膜。 应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。 四种常用膜分离过程的截留特性 本节 目录 4、层析分离 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 层析分离方法 层析方法 分离依据 吸附层析 利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 分配层析 利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离 离子交换层析 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 凝胶层析 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 亲和层析 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 层析聚焦 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。 吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。 层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。 在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。 溶剂洗脱法 置换洗脱法 前缘洗脱法 分配层析 分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。 分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。 凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。 酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用. 亲和层析的四个要素 常用的亲和介质及专一性配体 根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为： 共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析 疏水层析与反相层析的基本原理 本节 目录 5、电泳分离 带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：