医学一氧化碳中毒实验和形态学综合实验技术课件.ppt

一氧化碳中毒实验和形态学综合实验技术 目的和要求 1．掌握形态学实验技术基本方法和技能 2. 掌握形态学科学研究手段和程序 3. 熟悉实验论文撰写的方法与步骤 实验技术路线 实验组 对照组 复 制 动 物 模 型 取材 石蜡包埋 切片 HE染色 免疫组化染色 图像分析技术 实验内容 通过一氧化碳中毒实验,了解科研时动物模型复制基本方法; 通过HE染色,观察一氧化碳中毒对动物大脑皮质组织结构的影响; 通过免疫组化染色,观察一氧化碳对神经元内神经营养因子活性的影响; 通过图像分析,对免疫组化染色结果进行定量分析。 实验方法 1. 一氧化碳中毒动物模型复制 2. 石蜡包埋技术 3. HE染色技术 4. 免疫组织化学技术 一氧化碳中毒实验 原 理 一氧化碳中毒,红细胞内血红蛋白与一氧化碳结合,而与氧结合能力降低,进而导致组织缺氧。 脑组织缺氧可导致脑体积增大,脑沟变浅,脑回增宽,切面见点状出血;小灶状坏死;神经元变性、坏死;小胶质细胞增生、肿胀、吞噬脂质而呈泡沫状等一系列病理变化。 操作步骤 1．将动物分为2组, 把小鼠放入广口瓶内; 2．实验组动物: 给予一氧化碳吸入,待小鼠出现明显呼吸困难、烦躁、晕厥时开瓶塞,使小鼠苏醒; 对照组动物: 不吸入一氧化碳; 3．第二天重复上述操作, 连续四天, 致小鼠急性中毒死亡。 4．切开小鼠皮肤, 用咬骨钳打开颅骨,  暴露脑组织; 5．分离脑膜后,进行大体观察: ﹡ 脑体积变化, ﹡ 脑沟变化, ﹡ 脑回变化, ﹡ 有无出血、坏死灶; 6．取出脑组织, 置于固定液 7. 石蜡包埋技术: 8. 分别染色: HE染色技术 免疫组化染色技术 在显微镜下要观察人体组织,必须将组织切成以微米为单位的薄片,使其透光并易于观察,但直接切取柔软组织是难以办到的。 三 操作步骤 1. 取材 直接取材或灌注后取新鲜组织 (不超过6h),切成3×5×2mm小块。 2. 固定 保持细胞原有形态和结构,解决组织 自溶问题。10﹪中性甲醛、4﹪多聚甲醛等。 3. 冲洗 自来水流水冲洗, 目的:停止固定液 对组织的作用,去除固定液,以免影响染色。 4. 脱水 通常多用酒精脱水,为减少组织收缩,脱水酒精的浓度必须由低浓度开始,逐级升高浓度。 60﹪ (1h)→70﹪ (1h)→80﹪酒精(1h)→90﹪ (1h)→95﹪I(1h)→95﹪II(1h)→100﹪I (1h)→100﹪ II (30min)。注意: 脱水的具体时间视组织块大小体积与厚度而定。  自动脱水机 5.透明 透明剂常有二甲苯、冬青油等等。常用方法:1/2冬青油→冬青油→二甲苯洗涤。 6.浸蜡 将透明组织移入已熔化的石蜡中,使熔化的石蜡能浸透到组织中,然后包埋成组织蜡块。浸蜡过程在温箱中进行,温度不能超过60oC,温度过高或时间过长,组织容易收缩和脆变。方法:1/2石蜡→石蜡I→石蜡II→石蜡III。 7.包埋 将组织块和石蜡置于包埋框内,冷却即成蜡块,组织获得了一定硬度和韧度,就可以切成微薄的切片。 8.切片 载玻片先用蛋白甘油处理; Leica切片机进行切片,厚5μm; 45oC漂烘仪内进行展片。 9.裱片 10.烤片 HE 染色实验技术    苏木精(hematoxylin) : 碱性染料  伊红(eosin):酸性染料  操作步骤 1、脱蜡:  石蜡切片常规脱蜡至水 二甲苯 → 100﹪酒精 →95﹪酒精 → 80﹪酒精 →70﹪酒精 → 蒸馏水。 2、苏木精染色:5~ 10 min,核染成蓝色。 3、分色:0.5﹪盐酸酒精分色,镜下控制。 4、蓝化:自来水冲洗1~ 2h。 5、伊红染色:1--2 min,将胞质染成红色。 6、分色:90﹪酒精分色,镜下控制。 7、脱水:95﹪酒精 → 100﹪酒精 X 2 8