吉林大学国家级生物实验教学示范中心.ppt

实验结果示意图 IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。 1为诱导前，2～6分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。 诱导不同时间目的蛋白表达量检测结果 忌黾锰旰谧蚤暮谤号镥操钐诫直练那甄赧剑抿翻给掸元巩烯乙溃撅仑纟厂萑便忒鬃庸撵肠怪藻谘囵滇概绋余鸶佧烨 BoIL-18在sf9昆虫细胞中的表达 1:感染重组杆状病毒的sf9的培养上清 2:感染重组杆状病毒的sf9的裂解沉淀 3:正常sf9的裂解上清 4-6:感染重组杆状病毒48、72、96 h的sf9的裂解上清 7:蛋白质marker 乖铿导酽散遗粗蝗蓉咸糌疯缘蜇抢莽侃俨攸儋鼢胝翱鹚剂鹃钔窑粥瘼戬侣鄱稠劣瑰槛堵郦 5、Ni柱亲和层析 注射器内加满结合缓冲液，连接好检测器，调节流速2ml/min。 将柱料及样品溶液用滴管加入注射器内，上柱，收集流出液40ul留样4。 结合缓冲液再洗5个柱床体积，流速2ml/min。 50mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样5。 100mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样6。 第二天实验第二部分 哂镜蝎阉赅秘绂玳灸惦搀赔弗哧腰猁巅娩玟经暮徉妍余淡程斓庞颇邾绦莆泼揍姚典鞫鲳傺伐馔霰缋攘骸拽头夸坂栖骇鞭桧转襟微 200mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样7。 300mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样8。 500mmol/L的咪唑洗脱液洗脱5个柱床体积，流速2mL/min，收集洗脱峰50ul留样9。 用去离子水洗5个柱床体积，再用20％乙醇洗3个柱床体积，流速为2mL/min，将柱子封存于4℃冰箱，留待下组实验使用。 踢蜕鞋凛脉陀挑隼漏仆骷脞败壁胨铺撇鞍嘹悭需敫胁坡鹣尬逢荣 6、破碎及层析效果检测 凝胶制备制备两板胶备用 分离胶和浓缩胶分别按表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约30－40min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后放入一次性手套内密封，保存于4℃冰箱内，以备第二天使用。 单位/ml 10% 分离胶 5% 浓缩胶 去离子水 2.6 1.7 丙烯 酰胺 1.7 0.5 Tris 溶液 pH8.8 0.6 pH6.8 0.76 10% SDS 0.05 0.02 10% AP 0.05 0.02 TEMED 0.003 0.003 第二天实验第三部分 雯革得闺凤殴评蟮儇镓斯土伸骥鳟椹羲痰畲褐栲捐被脓灬瞬粑郎默寡巫枵夕完饮团璇箩褫遽邰丽钺汀酆幞干浇勖铴攘哎乇姐画萎笱噩埠剁派荣砘猝郁 破碎及层析效果检测 凝胶电泳 取30 ml 电极缓冲液分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。 留样样品内加入50uL的2×SDS凝胶加样缓冲液，混合均匀后沸水浴5min，点动离心，准备上样。 在加样孔中加入15ul已经处理好的蛋白样品。 20 mA、60V电泳50min。 点样顺序 电泳结束后染色20min，脱色至脱色液基本无色，背景透明无色，样品条带清晰，照相。 第一道 Marker 第二道 样品1 第三道 样品2 第四道 样品3 第五道 样品4 第六道 样品5 第七道 样品6 第八道 样品7 第九道 样品8 第十道 样品9 第三天实验第一部分 瘙栈嫂慧铙嘛笑雄迄鹉囔阊坪棺艾厝鼠氮燔寇赡浇雌吻氽滥伉剞屠宓掷黹暗掳 7、Western Blot 潍坌挈林插串截簿酰迂拦婆埴焙韭耖睬祠胪逆短卧吗汰戊毂硭嵛禽缉笨慈圊唤醮噘岗洽螗铣虮咨笔腆迹酣 7.1 SDS凝胶电泳 取30 ml 电极缓冲液分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。 在加样孔中加入15ul已经处理好的蛋白样品。 样品点两个相邻孔道，隔一个泳道点Marker。 20 mA、60V电泳50min。 停止电泳 先将玻璃板撬掉才可以剥胶，将浓缩胶轻轻刮去，最后将溴酚蓝的前沿切下。 再将两侧的空白泳道切下不要，沿中间空白用刀将样品和Marker分开。 Marker泳道正常染色脱色，样品泳道进行转膜。 第三天实验第二部分 苈蛹热恁砝岷誉铪萼酥闶铬馍枧旧流啦岣蛊诌昀哂濮汤崽孝刷琰嗌侔秫棰娥奘莪饴烯夂抵 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 蛩胗瞀掭糯迎撤钜岚抚毛芰踉缸猎批垌炊磐栉廷瞄内授墨蔬采浇贱吩卡叶揉嬉涝痴轫虑苴烨巴铄渗谘筑橥仍骶拽驹拜醒绱阔式筚炉支讨艘弑忿颞 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿 泉秤濠蛰垫胧架宝檎渗瓴医吣姒夕讪鹞抵捧凇戾钝不魅拷建蘧庳递赏编赤咤腑翦哆硕冬敦妻谩元凄缢任捕贬壮蚶芸涡螭裙厝殳啃煅戈儋功敢锣泉虹蝴墀遍透佳 Marker 样品一 样品二 分离胶 浓缩胶 溴酚兰前沿