生化研究生实验3 重组质粒DN提取及双酶切鉴定.ppt

* * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成 ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） * 溶液III：HAC和KAC组成的高盐溶液(复性作用) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕并使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 实验步骤及注意事项 加1.5ml培养物于EP管，12000rpm×30S ① ? 除去上清，加入冰的100 μl溶液I，颠倒EP管，混匀 ? 加入200μl溶液II，温和混匀，冰浴3~5min ? 加入150μl冰溶液III，温和混匀，冰浴3~5min，12000rpm×5min ② 转移上清到新EP管，加入等体积酚，12000rpm×5min ③ 转移上清到新EP管，加入等体积氯仿/异戊醇，12000rpm×5min④ ? 上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置20min，12000?5min ⑤ ? 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm×5min ⑥? 去上清，管平放室温静置10~15min ， 20 μl TE 溶解DNA ? 注意事项： 1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型（pUC119-U6 ）； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤。 二、限制性内切酶切割重组质粒 1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease） 能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。 * 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 影响限制酶活性的因素 1）“星”活性 酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性。 EcoRⅠ：GAATTC EcoRⅠ*： AATT 2）甲基化 识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 3）底物性状 4）试剂：缓冲系统 pUC18/19酶切位点的分布示意图 2 BamHI 、HindⅢ酶切重组质粒及鉴定 1 实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA） * 重组质粒 BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 5-G A A T T C-3‘ 3-C T T A A G-5 BamHI 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III 2 实验材料: 重组质粒; BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶;反应缓冲液;琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。 * 3 实验步骤: A 建立反应体系 B 酶切反应（温育1-3h） C 电泳鉴定 * 4、双酶切体系： 质粒DNA 10μl