第二讲限制性酶的反应系统.pptVIP

分子克隆工具酶 ——限制性酶的反应系统 限制性内切酶同其他酶类一样，反应系统应包括酶、底物和反应缓冲液，并且还需要合适的温度。 1限制性酶的反应系统 1.1 底物DNA 限制酶的底物是dsDNA分子（或其片段），作用位点在识别序列上。 1.1.1 DNA样品纯度 在样品中，若含有蛋白质，或没有去干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿等，均会降低限制酶的催化活性，甚至酶不起作用。 1限制性酶的反应系统 1.1.2 DNA分子构型 限制酶切割线性分子的效率明显高于切割超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。 1限制性酶的反应系统 1.1.3 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸是不具有催化活性的。 例：EcoR I GAATTC 解决方法：在识别序列两侧加适当碱基。 GGAATTCC 只有加适当碱基，才能达到正常的切割效率。 1限制性酶的反应系统 1.1.3 识别序列的侧面序列 在PCR引物设计时，若在PCR产物末端有某种限制酶的识别序列，则处于末端的识别序列的一侧应该有一个或几个“保护”核苷酸。 SphI 5’GCATCCAAGGATCCGAC3’ 5’GGGCATCCAAGGATCCGAC3’ 1限制性酶的反应系统 1.1.3 识别序列的侧面序列 特例：SalI和SpeI等限制酶的识别序列两侧不加 “保护” 核苷酸，同样可以被识别和切割。 1限制性酶的反应系统 1.2 位点偏爱(site preferences) 某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。 不仅侧面序列长短与限制酶的切割效率有关，而且侧面序列的核苷酸组成与切割效率也有关。 在pBR322中，NaeI 有4个识别序列，位置分布在：403、771、931和1285处。 一般情况下，403和771可迅速被 NaeI切割，931稍微慢些，而位于1285处的识别序列，切割效率只有其他的1/15. 1限制性酶的反应系统 1.3 DNA甲基化 限制酶作用：降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。 甲基化酶作用：对自身某个碱基进行甲基化，从而保护自身DNA不被降解。 一旦在识别序列中的核苷酸被甲基化，就会影响酶切的效率。 1限制性酶的反应系统 1.4 反应缓冲液 反应缓冲液中应含有氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT)或巯基乙醇、Tris（三羟甲基氨基甲烷 ）—HCL或Tris—Ac. 1.4.1 PH值 7.0—7.9 1.4.2 Mg2+ 酶活性中心，由氯化镁提供 1.4.3 DTT 提供一定的还原能力，促进连接反应有效进行。 1.4.4 BSA（小牛血清清蛋白） 稳定剂，有些酶在低浓度下不稳定或活性低，加入BSA后提高活力。 1限制性酶的反应系统 1.5 反应温度 一般是37℃ 一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下,反应速度最大。 1限制性酶的反应系统 1.6 反应时间 一般为1h或更多。许多酶延长反应时间，可以减少酶的用量。 例：EcoRI 若反应时间为16h，则所用酶量为只酶切1h的1/8. 1限制性酶的反应系统 1.7 酶量 反应系统中酶量取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品。 1.7.1 酶活性 1.7.2 底物DNA 限制酶有效作用的不是DNA分子的全序列，而是其中特定的识别序列。 1限制