法医DNA提取方法课件.ppt

法医DNA提取方法 Chelex-100法： 原理： Chelex是一种以亚氨二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚物，对多价金属离子有螯合作用，可防止DNA在煮沸加热前被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用。这样既可减少DNA的损失，又可削除扩增中的一些抑制因素。 Chelex-100法： 优点：快速、方便，且仅在一个管内进行， 减少污染 缺点：DNA提取的浓度小，对检材条件要求较高，对被泥土、石灰粉、染料污染的检材效果不佳，常导致扩增效率下降或失败。 Chelex-100法： 所取全血与DNA含量之间的关系： 全血（ul） 理论DNA 产量（μg） 1 0.04~0.06 10 0.2~0.4 100 2~4 200 4~6 400 8~10 Chelex-100法： 注意事项： A．核膜和其它试剂一起保留下来了，DNA纯度比有机溶剂提取法低； B．chelex-100法将DNA双螺旋打开，不能用像EB染料插入方法进行定量，只能用杂交方法定量； C．由于沸水浴8min和快速振荡使DNA片段受到损害而断裂，对于大于500bp的片段扩增成功率低。 D．chelex-100在配置数小时后螯合能力就有下降趋势，将会导致提取的DNA溶液中有各种金属离子或抑制剂，对PCR反应可能有影响。 酚/氯仿/异戊醇法 原理： 通过酚-氯仿混合物萃取 DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留 DNA 于水相溶液 中。 优点： 适用所有生物检材，提取 DNA 分子结 构完整，特别适合 RFLP、测序等需要大分子 DNA分析技术。 酚/氯仿/异戊醇法 缺点：操作步骤复杂，需要多次更换离心管，容易交叉污染； 注意事项： a. 操作中注意避免交叉污染； b. DNA得率较低，不适合微量DNA检材； c. 操作的误差所可能残留的成分可能抑制PCR反应，各种成分对PCR的抑制作用如下： 几种盐类对PCR的抑制浓度： 盐析法： 原理：利用6M的NaCl或醋酸钠沉淀蛋白质代替有机酚-氯仿抽提步骤去除蛋白质，其他过程同有机溶剂提取法。 优点：操作简单，步骤少，不使用有毒害的化学试剂酚和氯仿 缺点：得到的DNA盐浓度较高，对下游的PCR反应影响较大 .磁珠法 ： 原理： 利用磁性硅胶吸附白细胞，用细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的DNA分子被吸附到磁性颗粒表面，蛋白质等分子不被吸附而留在溶液中。在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，回收颗粒，再用纯水或TE洗脱吸附的DNA。 磁珠法： 优点： 不需要离心，操作简单； 在同一个反应管内提取，没有样品的损失，更适合于自动化提取； 与chelex-100提取法相比，磁珠法回收率高，即使是0.5μl血仍能得到DNA分型而用chelex-100提取同样量的血DNA有时不能得到分型。 硅珠法： 原理： 在高浓度的硫氰酸胍的存在下，DNA被二氧化硅特异性的吸附，被吸附的DNA在没有硫氰酸胍存在下，DNA又从二氧化硅释放出来，硫氰酸胍是高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA分离，在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质等不溶物除去，吸附后的漂洗可将溶液中的PCR抑制物除去。 硅珠法： 优点： 提取的DNA比较纯，回收率高，可以从0.5μl的血液中提取到足以进行PCR反应的DNA。 FTA技术 FTA技术的核心是一种专利化合物，FTA卡片预先被此种化合物浸透，当血液与FTA卡接触后，细胞膜被裂解，蛋白质发生变性，DNA分子则被捕获并与载体牢固结合，而且FTA卡片上的DNA可在室温下长时间稳定保存，FTA卡可保护其上的DNA免受核酸酶、氧化作用、紫外线、细菌和真菌的影响，生物检材中可能存在的病原体与FTA卡接触后也将失活。 保存的DNA可以方便快捷的进行纯化和洗脱。 * *