液相色谱讲稿1文档(山东大学药学院).docVIP

高效液相色谱法 学习要求 1、理解反相色谱法的分离机制 2、理解流动相对分离度影响的概念 3、理解利用纯物质对照定性的方法 4、掌握外标法定量的原理及计算公式 5、了解固定相（填充剂或填料）和流动相对色谱 条件选择的作用 6、了解固定相和流动相特点 第一部分 概述及HPLC主要类型 一、HPLC的发展 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵输送流动相、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备分析速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 二、特点 1、适用范围广； 2、分离性能好；应用了颗粒极细（10微米以下）、规则均匀的高效固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高。 3、分析速度快； 4、流动相可选择范围宽； 5、灵敏度高；广泛采用了高灵敏度检测器，大大提高了灵敏度。如：紫外检测器的最小检测限可达10-9g，荧光检测器的最小检测限可达10-12g。 6、色谱柱可反复使用； 7、流出组分容易收集； 8、操作自动化； 9、安全。 三、液相色谱分离原理 根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离，其实质是溶质与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用力，作用力的大小决定色谱过程的保留行为。 第二部分 HPLC的主要类型 一、根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱、以及分子排阻色谱等类型。 二、化学键合相色谱法 （一）、定义： 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC) 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相 。 化学键合相一般采用硅胶为载体（薄壳型或全多孔微粒型）。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物起反应，制备化学键合固定相。 （二）、优点： 1、均一性和稳定性好； 2、不易流失； 3、使用周期长； 4、柱效高，重现性好； 5、流动相和键合相种类多，分离选择性高。 （三）、分类 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱可分为正相（NP）和反相（RP）键合相色谱法。 正相键合相色谱--固定相极性强，流动相极性小，通常用于分离极性化合物，极性小组分先出柱，极性大的组分后出柱。 反相键合相色谱--固定相极性弱，流动相极性大，通常用于分离非极性化合物，极性大组分先出柱，极性小的组分后出柱。 （四）、反相键合相色谱法（简称反相色谱法）： 是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。 1、分离机制：疏溶剂理论； 2、固定相：极性小的烷基键合相，如C8柱，C18柱(ODS 柱)； 3、流动相：极性大的水-甲醇或水-乙腈，底剂(水)+ 有机调节剂； 4、流动相极性与t的关系： 流动相极性↑，组分tR↑； 5、出柱顺序： 极性大的组分先出柱，极性小的后出柱；6、适用性：可分离多环芳烃等非极性至中等极性的组分（还有有机酸、碱及盐等）（用于HPLC 80%）。 三、分离机制(疏溶剂理论，双保留机制，顶替吸附-液相相互作用模型等) 疏溶剂理论：主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 这一理论把非极性的烷基键合相，看作在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏水剂作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用；另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。 在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 第二部分 HPLC的固定相和流动相 HPLC法的关键是选择最佳的色谱操作条件，以实现理想的分离。在色谱条件中，固定相（填充剂或填料）和流动相是关键的条件，直接关系到柱效、选择性和分离度。 一、固定相 （一）、固定相应符合下列要求： 颗粒细且均匀； 传质快； 机械强度高，能耐高压； 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 （二）、固定相的分类：主要有化学键合相，液-固色谱固定相等固定相。 化学键合相色谱法的固定相 1、键