从不同生长阶段的大田黄麻中提取RNA以便于进行有效的分子下游分析课件.pptVIP

黄麻简介 黄麻(jute)为椴树科(Tiliaeeae)黄麻属(Corchorus)一年生草本韧皮纤维作物，是世界上最重要的长纤维作物之一。作为天然纤维，具有产量高、质地柔软、抗菌、抑菌、易染色、抗静电、易降解等优良特性，有“黄金纤维”之称。 提取RNA的主要障碍 具有坚硬的细胞壁。 富含多种次生代谢物，如多糖、多酚、蛋白质等物质， 在细胞破碎后，这些物质将以不同方式干扰RNA的提取，如酚类物质氧化后可使RNA活性丧失，多糖可形成难溶胶状物质与RNA一起沉淀。 RNA酶广泛存在且稳定，引起RNA的降解。 提取RNA的其他方法 苯酚/SDS法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除除去蛋白等，用NaAC和乙醇沉淀RNA。 异硫氰酸弧法（GITC）：用异硫氰酸弧变性蛋白并抑制RNase的活性，经酚氯抽提后再沉淀。 Trizol法：Trizol试剂 可同时分离样品中的DNA/RNA/蛋白质，主要成分是苯酚，8－羟基喹啉等。 本文设计的方法（HBIC） 增加了提取缓冲液的体积。增加十倍缓冲液的体积可以有效裂解细胞和稀释酚类物质。 将β-巯基乙醇与PVPP同时添加到样品中。有效抑制酚类物质的氧化与RNase的活性。 添加CsCl来去除不溶性的胶状粘液。 研究过程 研究过程 采集材料 提取总RNA Northern Blot Analysis mRNA 提纯 RT –PCR 构建cDNA文库 鉴定与测序 采集材料 次生生长之前，即发芽后7天的茎组织。 形成纤维的活跃期，即发芽后45天的茎组织。 样品采集自大田中，用DEPC（RNA 酶抑制剂）处理过的水冲洗。放入液氮中冷藏。 提取总RNA ①取1g茎组织在预冷的研钵中，在液氮中粉碎与研磨。加入2% β-巯基乙醇和0.2% PVPP，充分混匀。变性蛋白质，吸附多酚类物质。 ②提取缓冲液（10 ml 硼酸缓冲液和100 μL诺乃洗涤剂P40）放入30ml 无菌离心试管中于80℃ 水浴15min ，然后与上步中的样品溶液以10;1 的比例加入。剧烈振荡 5min，充分降解 基因组 DNA 。然后 在室温下 以 12,000g 的转速 离心10min。充分裂解细胞并稀释酚类物质。 ③转移水相至新离心管中。加入同等体积的氯仿，剧烈振荡5 min，以17,300g的转速离心10 min。去除脂类杂质，蛋白质变性。 提取总RNA ④转移水相至新离心管中，加入醋酸钠（PH 5.2），加入两倍体积的遇冷的乙醇，然后放入-20℃ 储藏 1h。沉淀RNA ⑤ 然后将材料在4 ℃ 以 12,000g 转速 离心十分钟。 收集 颗粒沉淀物 并 干燥。 ⑥将 最后得到的颗粒沉淀物溶解于5ml 的 DEPC 处理过的水中，加入2g CsCl 并轻轻混合。溶解RNA沉淀中的粘性胶状物。 提取总RNA ⑦将加入CsCl后形成的凝胶状的物质倒出。将澄清的溶液转移至超速离心管中，加入5.7 M CsCl 和5 mM EDTA 溶液，至 2,4ml。轻轻盖上离心管的盖子，在18 ℃ 下259,182g 离心3h，用一个垂直的转子(Beckman 90 Ti)。进一步抑制RNase活性。 ⑧吸掉上清液 ，用70% 的乙醇 冲洗颗粒沉淀物 并烘干。 用750 μl 的 DEPC 处理过的水 溶解 干燥过的颗粒沉淀物。加入同等体积的饱和苯酚 去除残余的DEPC。 ⑨加入相同体积的氯仿与异戊醇（24:1 ）的混合液去除残余的苯酚。4 ℃ 12,000g 离心10 min。 提取总RNA ⑩取上清液，加入1/10th体积的3 M 醋酸钠和二倍体积的遇冷的乙醇 。在 -20℃ 保存 1 h以充分沉淀RNA。干燥再一次得到的颗粒状沉淀物，溶解于100 μl 的 甲酰胺中，于 -70 ℃ 中保藏以备用。 电泳检测 用溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶检测 18S 和 28S rRNA 条带。 电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值。如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，认为RNA的质量好。 吸光度测定 280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。A260/A280(R)=1.8~2.0,说明提取的RNA可用。R＜1.8，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，R＞2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。 Northern Blot Analysis 首先用1.2%的变性凝胶电泳分离从成熟组织上提取的总RNA，然后用真空转移仪转移到尼龙薄膜上，用于杂交的探针是用P32 标记的700bp长度的泛素基因，杂交过程在65℃ 保持18h，然后用2×，1×，0.5×，0.2×，