临床生物化检验实验（一） 实验三 血清总蛋白、白蛋白及白 球比值的测定.ppt

实验三 血清总蛋白、白蛋白及白/球比值的测定 蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品、药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 血液的组成： 血液的组成 血浆(plasma) ——血液中加入抗凝剂后离心,使血细胞下沉, 所得到的上清. 血清(serum) ——血液凝固后析出的淡黄色透明液体 实验目的 1、熟悉血清总蛋白的测定方法（双缩脲法） 2、熟悉血清白蛋白的测定方法（溴甲酚绿法 ） 3、掌握血清总蛋白、白蛋白和白/球比值测定的临床意义  问题：如何测定蛋白质的浓度？ 根据蛋白质不同性质建立的蛋白质浓度测定方法： 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法（Biuret）、Lowry法(Follin-酚法)等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 在选择方法时应考虑 实验对测定所要求的灵敏度和精确度 蛋白质的性质 溶液中存在的干扰物质 测定所要花费的时间 PartⅠ 总蛋白的测定（双缩脲法） 临床意义 1．血清总蛋白增高 ①血液浓缩，导致总蛋白浓度相对增高； ②血浆蛋白质合成增加。 2．血清总蛋白降低 ①血液稀释，导致总蛋白浓度相对降低； ②摄入不足和消耗增加； ③合成障碍； ④蛋白质丢失。 实验原理 实验原理 蛋白质与双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色配合物(即双缩脲反应) 其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 实验材料与试剂 1. 721分光光度计，1.0cm比色皿 2. 试剂 （1）生理盐水 （2）双缩脲试剂 称取硫酸铜3.0g溶于500ml蒸馏水中，加酒石酸钾钠9.0g，碘化钾5.0g，待完全溶解后，加入24％ NaOH 100ml，并用蒸馏水稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。 （3）10mg/ml 牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA，蛋白质标准液） （4）稀释血清：待测血清用生理盐水按1:10稀释 操作步骤 取3支试管，按下表操作 计算 参考值 60~80 g/L 注意事项 1．双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾为稳定剂，能防止碱性酒石酸铜自动还原 。 2．由于各种血清蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。 3．高脂、黄疽及溶血标本应作血清空白对照来校正误差。 PartⅡ 白蛋白的测定（溴甲酚绿法 ） 临床意义 1．血清白蛋白浓度增高　常见于严重脱水所导致的血浆浓缩。 2．血清白蛋白浓度降低　在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。当血清白蛋白低于20g/L时，临床上出现水肿。 3．A/G比值：正常值范围为1.5~2.5。某些病人可同时出现白蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者A/G比值1.0，称为A/G比值倒置。 实验原理 本法是在不分离血清中白蛋白的情况下直接测定白蛋白的一种方法。 白蛋白具有与阴离子染料结合的性质，在pH 4.2的环境中，带正电荷的白蛋白(pI 4.9)与阴离子染料溴甲酚绿(bromcresol green，BCG)结合，由黄色变为绿色。 蓝绿色的深浅与白蛋白的浓度成正比。 因此，应用BCG法可以直接测定血清白蛋白的含量。 试剂中加入非离子型表面活性剂，可提高蛋白质与染料的结合力和溶解度，在一定浓度下能提高呈色的稳定性。 实验材料与试剂 1. 721分光光度计，0.5cm比色皿 2. 试剂 （1）工作试剂： 琥珀酸缓冲液 pH4.2 表面活性剂：2.0 g/L 溴甲酚绿：0.1mmol/L （2）白蛋白标准液：4.0 g/L （3）稀释血清：待测血清用生理盐水按1:10稀释 操作步骤 取3支试管，按下表操作 计算 参考值 白蛋白：35~55 g/L A/G：1.5~2.5 注意事项 1．BCG除与白蛋白结合外，还可与α-球蛋白及β-球蛋白结合，但后者结合速度较慢，其显色强度分别为白蛋白的20%及10%。因此本方法操作中应控制比色时间，在BCG加入后30秒内完成测定，避免球蛋白参与反应。 2．BCG本身是一种pH指示剂，变色域为pH3.8(黄色)～5.4 (蓝绿色)，因此控制反应液的pH是本法测定的关键。 实验安排 每个大组分2个小组