实验11 心理应激性失眠对大鼠脑组织P物质表达的影响课件.ppt

心理应激性失眠对大鼠海马P物质表达的影响 主讲人：桂 丽 职 称：助理实验师 邮 箱：tcguili@163.com? 单 位：安徽医科大学形态中心实验室 一、目的和要求 1.了解心理应激性失眠模型复制方法； 2.掌握脑立体定位技术及睡眠时相的记录方法； 3.观察睡眠时相和睡眠结构，分析其意义； 4.观察心理应激性失眠对大鼠海马神经元细胞 P物质表达的影响。 二、内 容 1968年Rechtschaffen和Kales等根据EEG、EMG、EOG等生物电变化指标，制定了睡眠分期标准，此方法得到国际认可，沿用至今。 失眠与情绪障碍心理应激有一定的内在联系。 应激可以引起与情感相关脑区P物质（SP）的释放，SP与睡眠有复杂的联系。 二、内 容 二、内 容 手术 模型的建立 睡眠描记及分析 记录电极通过微型插座连接到八道脑电仪上，同步记录脑电和肌电活动，每次描记从10：00开始，连续记录6h。以30s为一分段时间，将睡眠觉醒周期分为： 取材 于造模第15天，大鼠禁食12h，水合氯醛麻醉后剪开其前胸壁、心包，找到主动脉。 在升主动脉处插管，剪开右心耳，快速灌注生理盐水250 ml，直至流出的液体澄清透亮无血为止。继之快速灌注4%多聚甲醛250ml，直至大鼠肢体无刺激症状为止。 迅速开颅取脑,置入4%多聚甲醛24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片。 免疫组化染色过程 (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 (2) 30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温10分钟以灭活内源性酶。 (3) PBS洗5分钟×3次。 (4) 抗原修复 对于大部分指标，可以直接进入下一步；对于难以显示的抗原，可以将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH 6.0）电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟后，反复1-2次，冷却后PBS洗5分钟×3次。 (5)滴加正常山羊血清封闭液，室温30分钟。甩去多余液体，不洗。 (6)滴加适当稀释的一抗（兔抗小鼠），37 ℃ 1-2小时或4 ℃过夜。 免疫组化染色过程 (7) PBS洗5分钟×3次。 (8) 滴加生物素化二抗（羊抗兔），37 ℃1小时。 (9) PBS洗5分钟×3次。 (10)滴加试剂SABC，37 ℃1小时。 (11)PBS洗5分钟×3次。 (12)DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1毫升蒸馏水，加试剂盒A，B， C试剂各1滴，混匀后滴加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5-10分钟之间。也可以自配显影剂显色。蒸馏水洗涤。 (13)苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。 (14)结果 阳性细胞呈棕黄色或棕褐色。 三、实验结果 简述心理应激性失眠导致SP表达变化的可能机制及意义。 免疫组化染色过程中注意应什么? Thank you very much! * * 原 理 1 操作步骤 3 材 料 2 心理应激性失眠发病率正逐年升高。 95%的成人曾发生过失眠，4.4－11.7%的人群患有慢性失眠，其中80%是心理应激性失眠。 1957年Dement和Kleitmen创建了多导睡眠图（PSG），同时记录脑电图，肌电图，眼动图，心电图等多种生物电活动，综合分析睡眠时相。 原理 1 原 理 1 操作步骤 3 材 料 2 材料 动物： 大鼠 器材： 手术刀剪、镊子、血管钳、螺丝钉、 电焊、 Leica 2135切片机、Nikon光学显微镜、 SN-2型脑立体定位仪、ND-828八道脑电图仪。 试剂： 一抗为兔抗鼠抗SP、二抗为羊抗兔IgG 血清、DAB显色试剂盒。 2 原 理 1 操作步骤 3 材 料 2 操作步骤 3 动物模型建立 取材 免疫组织化学染色 手术 睡眠时相记录 麻 醉 脑 立 体 定 位 固 定 安 装 铜 质 镀 金 螺 钉 插 入 银 丝 电 极 牙 科 水 泥 固 定 术 后 休 息 1 周 脑立体定位仪 大鼠制动模具 1 2 大鼠 置于束缚制动筒内,移动插片逐步缩小空间 每日一次，每日开始及持续时间不同 制动期间禁食禁水 第一天制动4h，以后每天增加半小时 NREMs REMs 表1 两组大鼠wake比例（％） Tab1 percentage of wakefulness in each group（％） 36.47±5.70 39.22±7.51 36.56±5.83 39.47±4.08 33.02±5.13 42.91±8.84** 35.86±10