提取方法步骤课件.pptVIP

RNA提取 工作环境： 1，人员极少的，空气流动 少； 2，物品储备专用橱柜； 3，试验工作台平滑整洁; 4, 实验人员整洁，装束免起沉； 5，所用器具均需RNA-free。 注意事项 纪律一：杜绝外源酶的污染。 注意一：严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。 纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。 Rnase 污染的10大来源  1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。 2：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。 3：水/缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。 4：实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。 5：内源 Rnase – 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。 6：RNA 样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。 7：RNA 保存 – 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。 9：阳离子 (Ca, Mg) – 在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。 10：后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。 工作日程安排 ①第一天器具干烤180℃，8hour（早8；00—下午4点) 干烤箱凉一个小时 ②晚六点处理DEPC（0.1%）水过夜。 ③第二天早八点DEPC （0.1%）水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中至第三天。 ④第三天早八点灭DEPC残留，DEPC废液灭菌四十分钟121 ℃ 。物品烘干（70 ℃）至无水残留。 ⑤第四天早晨提RNA并检测。 物品干烤 干烤物品：研钵，药勺，量筒（100ml） 量筒（50ml），500ml容量瓶，500ml磨口瓶,镊子，50ml三角瓶，大烧杯。 包装：容器以铝箔封口；研杵，药勺通体 铝箔包， 干烤： 180℃，8hour 干烤结束，在RNA专用柜中备用。 DEPC水制备 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。1L水加1mlDEPC。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用） 吸取DEPC，直接打入去离子水中，不要加到容器壁上。37 ℃在摇床上过夜。摇瓶仍以干烤时的铝箔封口，避光。 物品浸泡（戴好口罩，手套） 浸泡物品；1ml，200ml，10ml枪头，EP管。 浸泡时间：过夜 浸泡注意事项：EP管中一定要充满DEPC水，DEPC浸没所需浸泡物品，浸泡器具均干烤过。 溶液配制（戴好口罩，手套） TAE母液（50X） Tris2.42g,冰乙酸0.571ml，0.5mol/LEDTA(PH8.0)1ml,定容至100ml 0.5mol/LEDTA（PH8.0）： EDTA 18.61g，NaOH 2g，调PH8.0定容至100ml 溶液配制（戴好口罩，手套） 上样缓冲液（6x） H2O2稀释；30%H2O2（10ml）稀释至100ml（3%）H2O2 溶液配制（戴好口罩，手套） 75%酒精：375ml无水乙醇+125灭菌DEPC水 TAE稀释：10ml母液（50X）稀释至500ml。 琼脂糖胶配制：0.18g琼脂糖+18mlTAE，加一滴EB在凝胶50 ℃ RNA提取操作（戴好口罩，手套） 准备试剂：TRIzol，氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)，液氮。 磨样品台清洁：用清水擦拭后，用酒精擦拭。 超净台清洁：用酒精擦拭干净后，用氯仿快速擦拭超净台，再用酒精擦拭，超净工作台紫