Zn2+对基因工程大肠杆菌P84AMC1061发酵生产卤醇脱卤酶影响.docVIP

Zn2+对基因工程大肠杆菌P84AMC1061发酵生产卤醇脱卤酶影响 　　摘 要：主要研究Zn2+对基因工程大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的影响。以卤醇脱卤酶活力为响应值，通过单因素试验筛选出显著影响因子Zn2+，并确定其最优浓度为0.000 7 g·L-1；在50 L罐中进行分批发酵试验，比较分析卤醇脱卤酶活力、OD600以及在线参数OUR、CER等的变化趋势，发现Zn2+可显著促进重组大肠杆菌生长，提高生长速率，酶活提高了5.4%。 　　关键词：卤醇脱卤酶；锌离子；大肠杆菌；发酵调控 　　中图分类号：R378.2+1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.002 　　卤醇脱卤酶也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解此类化合物的关键酶之一，在治理环境污染方面具有十分重要作用。此外，在催化环氧化物和邻卤醇之间的转化反应中，卤醇脱卤酶具有很高的立体选择性，因而在手性药物合成方面也有广阔的应用前景。序列同源性搜索以及二级、三级结构预测表明，卤醇脱卤酶的结构相似于短链脱氢酶/还原酶家族（SDRs），它的3个重要的催化残基分别是：L-Tyr145、L-Ser132和L-Arg149[1-2]。卤醇脱卤酶是目前世界范围内的一个新的研究领域，目前的研究均仅限于卤醇脱卤酶基因的改造和优化，对于大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的影响因素及过程调控的研究甚少。 　　微生物在生长繁殖和产酶过程中，需要无机盐维持细胞的渗透压，并合成核酸等生命物质；某些微量元素如锰、锌、铁等对其生理活性物质（酶的活性中心或辅酶）的组成，或生理活性作用调节物（酶的激活剂）的作用有重要影响[3]。 　　关于Zn2+在生物界中重要性上的认识是个漫长的经历[4]，包括农业和畜牧业，最后在近100年来，发现在人体生长发育过程中，Zn2+在生理功能上和营养作用上具有极为重要的意义，从生命遗传物质核酸到代谢参与物—酶，都有Zn2+的作用，因而研究学者称其为“生命的火花”。但是，Zn2+在微生物代谢过程中的作用等相关研究在国内外成果不多，此方面研究有着十分重要的意义。 　　笔者主要对Zn2+在大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的过程进行研究，以确定影响菌体生长及卤醇??卤酶表达的Zn2+的最优百分比，并通过多参数相关分析的方法，探究Zn2+对卤醇脱卤酶生物合成影响的原理，为后续发酵过程优化以及生产放大奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 菌种 重组大肠杆菌E.coli P84A/MC1061，由安琪酵母股份有限公司菌种室提供。 　　1.1.2 试 剂 L-阿拉伯糖L（+）-Arabinose，购于Sigma公司。酵母浸出物FM888由安琪酵母股份有限公司生产。其它试剂均为分析纯AR。 　　1.1.3 培养基 斜面培养基（g·L-1）：甘油8，酵母浸出物（FM888）25，NaCl 6.0，KH2PO4 2.5，K2HPO4 2.5，Na2HPO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，琼脂粉15。摇瓶液体培养基（g·L-1）：甘油4，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5，微量元素2。50 L发酵罐液体培养基（g·L-1）：甘油12，酵母浸出物50，NaCl 2.0，KH2PO4 6.5，K2HPO4 6.5，Na2HPO4 3.5，MgSO4·7H2O 1.5。 　　1.1.4 诱导剂溶液 L-阿拉伯糖浓度0.05 g·mL-1。 　　1.2 培养方法 　　1.2.1 摇瓶培养 种子培养：将斜面菌样接入装有25 mL液体培养基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养20 h。发酵培养及诱导产酶：将种子液接入发酵摇瓶后，在30 ℃，200 r·min-1条件下培养，当发酵液OD600达到2时，加入0.5 mL·L-1阿拉伯糖溶液，发酵结束后收集菌体。 　　1.2.2 发酵罐培养 1级种子培养：将斜面菌样接入装有25 mL液体培养基的250 mL的三角瓶中，制备2瓶，在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养24 h。2级种子培养：将2 mL 1级种子瓶菌样，接入装有100 mL液体培养基的1 L的三角瓶中，制备6瓶，在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养20 h。发酵罐分批发酵培养：灭菌前加入15 mL消泡油，灭菌后将6瓶2级种子液合并，接入装有30 L液体培养基的50 L发酵罐中，在30 ℃、260 r·min-1、0.035 MPa下培养，当发酵液OD600达到2时，加入配制好的L-阿拉伯糖溶液