罗田板栗储存后期致腐真菌分离鉴定及致病性研究.docVIP

罗田板栗储存后期致腐真菌分离鉴定及致病性研究 　　摘要：为了研究罗田板栗（Castanea mollissima Bl.）储存过程中发生霉变的机理，从常温储存70 d后发生霉变的罗田板栗中分离其中的致腐真菌，经鉴定属于6个属，分别为束丝菌属（Ozonium sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、镰刀菌属（Fusarium sp.）、根霉属（Rhiopus sp.）、青霉属（Penicillium sp.）、葡萄穗霉属（Stachybotrys sp.）。对分离率大于10%的致腐真菌进行回接试验。结果表明，在无伤接种的条件下，除了青霉属导致较低的霉变率和较轻的病症外，其余真菌均无致病力；在有伤接种的条件下，各菌株导致的霉变率都在60%以上且大部分表现出较重的病症，其中束丝菌属和曲霉属导致的霉变率在80%以上。试验结果证明，板栗在有伤情况下更易腐烂，束丝菌属和曲霉属是板栗贮藏期腐烂的重要致病菌。 　　关键词：板栗（Castanea mollissima Bl.）；致腐真菌；分离鉴定；致病力；罗??县 　　中图分类号：S664.2；S436.64 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2305-04 　　板栗（Castanea mollissima Bl.）原产中国，为山毛榉科坚果类植物；其栽培历史悠久，营养价值高[1]。湖北省罗田县则是板栗的原生地之一，复杂多变的地理环境为罗田板栗品种的多样化提供了良好的生态环境条件[2]。罗田板栗是湖北省的特色农产品，具有外形美观、果大质优、果形端正均匀、色泽鲜艳有光泽、蜡质层浅薄、易剥、不黏内皮的特点；罗田板栗具有丰富的营养成分，其可溶性糖含量与各类氨基酸的总量高于国家标准，品质优于其他产地[2]。 　　由于传统栽培因素，罗田板栗在采收过程中存在一些问题，如采收期不合理、脱壳技术仍沿用传统的栗苞堆沤的方式，极易造成栗苞升温发酵，导致栗仁受伤[3]，加之板栗“怕干、怕湿、怕热和怕冻”的“四怕”特性[4，5]，导致板栗在贮存过程中腐烂变质严重，一般腐烂率达20%～30%[5]，造成巨大的经济损失。致病真菌是导致腐烂的主要原因，目前研究者对引起板栗储存过程中腐烂的部分致腐菌做了分离鉴定。各地的板栗因地区差异、贮藏方式不同，从中分离的致腐菌亦有很大差别[6-12]。至今尚未见针对罗田板栗储存过程中的致腐微生物的研究报道???故试验对常温储存下的罗田板栗中致腐真菌进行分离、鉴定及致病力研究，找出使罗田板栗腐烂的主要菌群，以期降低罗田板栗在采收、贮存过程中的腐烂损失，为科学采收、绿色储存作出指导。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　板栗样品为市场随机购买的罗田板栗，所用试剂为国产分析纯试剂。培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，加水至1 000 mL），培养基灭菌后每毫升加入30 U青霉素。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 材料处理 板栗常温储存70 d，选取外观带霉斑或漂浮于水面的板栗100个。去壳后用清水冲洗3次，选取病健交界处病组织（每个栗仁5块）切成边长2～4 mm的方形组织块， 75%乙醇浸泡3～4 s后转入50 mg/mL的次氯酸钠溶液消毒2～3 min，无菌水冲洗3～5次。 　　1.2.2 致腐真菌的分离 栗仁表面及内部真菌的分离采用组织分离法[13]。组织块点种到PDA培养基中，28 ℃倒置培养4～5 d，待平板出现混合菌落后对分离的各特征菌落进行统计计数，挑取单菌落继续分离纯化至单菌落。将纯化的单菌落编号、接种到试管斜面恒温培养。 　　1.2.3 致腐真菌鉴定 依据参考文献[13-15]对纯化的单菌落菌株进行分类鉴定。 　　1.2.4 致病力试验 根据柯赫氏法则进行致病性测定。分离菌接种于带壳的无病板栗上。接种前板栗用自来水冲洗后在75%乙醇和50 mg/mL次氯酸钠溶液中各浸泡10 min，用无菌水冲洗2～3次。接种采用2种方法，用解剖针刺伤外壳接种（有伤接种）和用接种环接种（无伤接种），3组平行，每组接种板栗60个。接种后置灭菌牛皮纸信封中于灭菌玻璃瓶中常温保存14 d后观察、统计各真菌导致的霉变率及霉变程度。再做分离并培养以确认病原菌。 　　1.2.5 霉变率及霉变程度评估 板栗果仁表面或内部出现霉烂即记为坏栗果。统计每一平行组的霉变率，霉变率=坏栗果数/样品栗果总数×100%，取其算术平均值为霉变率。霉变程度采取如下分级标准[6]：0级：未发病；1级：接种点处发病，病斑基本无扩散；2级：病斑占栗仁表面积的1/3以下；3级：病斑占栗仁表面积的1/3～3/4；4级：病斑占栗仁表面积的3/4以上。 　　2 结果与分析 　　2.1 霉烂板栗症状