高级生试验高效液相色谱2.pptVIP

反相色谱流动相极性的变化对分离的影响 * 反相色谱固定相极性的变化对分离的影响 * * 反相色谱固定相极性的变化对分离的影响 反相离子对色谱 原理：样品离子与流动相中离子对试剂的反离子生成疏水性离子对，而为反相色谱固定相保留 固定相：疏水性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂或键合的硅胶 流动相：水（缓冲液）+离子对试剂+有机溶剂 离子对试剂：所带电荷与待测离子相反 应用：有机酸、碱、盐的分离 * 正相色谱 流动相的极性小于固定相的极性 硅胶柱：常用 氰基柱：常用 氨基柱：分析糖 二醇基柱：分析蛋白质 * * 相互作用力是什么？ * 正相色谱流动相极性的变化对分离的影响 反相色谱与正相色谱的对比 反相色谱： 流动相极性大于固定相极性 适用于能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物分离 正相色谱： 流动相极性小于固定相极性 适用于不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物的分离和制备HPLC * 离子交换色谱 原理：利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异实现分离 固定相：离子交换树脂 流动相：水缓冲溶液（常用）或有机溶剂与水缓冲溶液的混合液 离子交换色谱作用力 * 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 尺寸排阻色谱法size- exclusion chromatography 空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 空间排斥（阻）色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 体积排阻色谱 Size Exclusion Chromatography M.W. tR 定性分析 色谱峰的定性鉴别： 通过保留值(通常是保留时间)进行定性 需要指定保留时间误差范围（时间窗、时间带） 在相同的分析条件下： 保留时间相同并不肯定是同样的组份 保留时间不同肯定不是同样的组份 定性确证 仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质 通过加入标准物确认 通过改变色谱条件确认 光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段 其他仪器方法确证 定量分析的基本要求 ??需要有纯物质作标准 ??被定量组分峰要与其它峰达到基线分离 ??符合定性参数要求 ??选择合适的定量方法 常用定量方法 ?? 面积归一化 ?? 外标法 ?? 内标法 ?? 标准加入法 HPLC已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： ①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分离模式。 ②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 ③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 ④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 END * * * 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography 任士芳 021renshifang@fudan.edu.cn 高效液相色谱是什么 高效液相色谱原理 高效液相色谱应用 内容和目标 色谱定义 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱 色谱是一种分离技术 色谱的主要目的是对混合物中的目标物 分离和定量 * 色谱分类 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 气相色谱 Gas Chromatography (GC) 薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC) 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis (CE) 高效液相色谱 (HPLC) 定义：以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 流动相具有运载样品分子和选