盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血所致学习记障碍的改善作用.doc

盐酸法舒地尔对大鼠慢性低灌性脑缺血Western blot技术增加nNOS的LTP）；nNOS 小G蛋白Rho参与调节多种细胞功能，如平滑肌细胞的收缩、细胞骨架的重塑、细胞粘附和移动、胞质分裂、基因表达等[1]。Rho激酶为Rho特征性的效应器。目前，Rho/Rho激酶途径在细胞水平的功能和信号转导已被广泛研究，然而，有关该信号通路在体水平的报道则很匮乏。盐酸法舒地尔（hydroxy fasudil, HF），一种Rho激酶特异性抑制剂，是研究Rho/Rho激酶信号通路非常有效的工具药[2]。该信号通路可以调节平滑肌收缩的最终阶段肌球蛋白轻链的磷酸化水平，与血管痉挛、动脉粥样硬化高血压等疾病的发生均HF可缓解及预防狗迟发性脑血管痉挛，改善狗迟发性脑血管痉挛模型的大脑皮质血流，选择性地增加脑血流量Rho激酶信号通路与神经细胞的生长和功能活动是密切相关的。在两种短暂性脑缺血动物模型小鼠大脑中动脉栓塞模型[7]和大鼠脑微血栓模型[8] 中，法舒地尔或盐酸法舒地尔可显著改善神经功能并减少脑梗死体积。Lehmann等报道C3毒素抑制Rho 从而促进神经轴突生长[9]。p160ROCK抑制剂Y-27632促进皮质脊髓束损伤大鼠的神经轴突生长，加快其运动功能的恢复[10]。因此，Rho/Rho激酶信号通路在神经损伤的病理生理过程中也占有重要地位[11]。 目前，有关Rho/Rho激酶在慢性脑缺血所致神经损伤的研究尚很少见。有研究指出：双侧颈总动脉永久性结扎致慢性低灌性脑缺血动物模型中，大鼠前脑区局部脑血流量和葡萄糖利用率均下降，而Rho激酶抑制剂HA1077可改善这些变化[12]。然而，Rho/Rho激酶信号通路是否参与慢性脑缺血所致认知功能障碍和神经元损伤？本实验中，我们采用永久性结扎双侧颈总动脉方法制作慢性低灌性脑缺血模型，观察长期给予盐酸法舒地尔对模型大鼠学习记忆能力和突触传递功能的影响。此外，我们还探讨了药物发挥作用的可能机制。 作者简介：黄琳(1982-)，女，药剂师，Tel: 010E-mail: linhuang621@ 1 材料和方法 1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠，体重180～220g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。大鼠随机分笼饲养，维持室温20~22℃，自由摄食与饮水，自然光照节律，每天提供足量的食物和水。 1.2 主要药品和试剂 盐酸法舒地尔(hydroxy fasudil，HF)，白色粉剂，纯度98%，Tocris Cookson Ltd. (Britol, UK)公司生产，批号040311，临用前用生理盐水溶解并稀释至所需浓度，注意避光；尼莫地平（Nimodipine）针剂，德国拜耳制药公司生产；兔抗鼠nNOS抗体购自Santa Cruz Biotechnology；即用型SABC试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司； PMSF、钒酸钠、Aprotinin、Pepstatin和Leupeptin均购自美国Sigma公司，ECL购自美国Pierce Biotechnology。 1.3 主要仪器 水迷宫检测仪器及软件分析系统：EthoVision, Noldus Information Technology BV, Wageningen, The Netherlands；SN-3型脑立体定位仪：日本Tokyo Narishige公司产品SEN-7203电子刺激器：日本NIHON KOHDEN公司产品SS-104J隔离器： 日本NIHON KOHDEN公司产品SMUP-PC生物信号处理系统软件：上海嘉龙教仪厂产品低温高速TGL台式高速冷冻离心机：湖南仪器仪表总厂离心机厂 DYY-8C型电泳仪：北京六一设备厂生产 1.4 动物模型制备 参考Ni等方法[1]，永久性结扎大鼠双侧颈总动脉2VO）。大鼠用10％水合氯醛0.35ml/100g腹腔内注射麻醉，仰卧位固定，颈部去毛，强力碘消毒，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，并套以“0”号线，分别结扎双侧颈总动脉的远近端，并从中间剪断，以确保阻断颈总动脉血流。缝合后腹腔注射生理盐水4～5ml，放回笼中饲养；假手术组除不结扎、不剪断双侧颈总动脉外，其余过程与手术组相同。术中保持大鼠肛温36.5℃～37.5℃。各组大鼠同条件饲养，在相同时间点作各种检测。 1.5 实验分组与给药 Sprague-Dawley大鼠随机分为五组：假手术组脑缺血模型组；HF低剂量治疗组：2VO + HF 1 mg/kg；HF高剂