玉米淹水诱导表达ZmERF5基因启动子克隆与生物信息学分析.docVIP

玉米淹水诱导表达ZmERF5基因启动子克隆与生物信息学分析 　　摘要： 根据玉米（Zea mays L.）自交系B73 ZmERF5基因启动子的DNA序列，利用PCR技术分别从玉米自交系Hz32（耐渍系）、Mo17（敏感系）中克隆出该启动子。ZmERF5基因启动子在Hz32和Mo17中DNA序列没有差异，大小均为1 098 bp。生物信息学分析表明，ZmERF5基因启动子含有多个厌氧响应顺式元件：2个GARE motif、2个MBS、1个ABRE motif、1个TCA element、1个CGTCA motif、1个G box和1个O2-site。因此，推断该启动子受激素调控，且是淹水诱导型启动子。 　　关键词：玉米（Zea mays L.）；淹水胁迫；诱导表达；启动子 　　中图分类号：S512.1；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5880-04 　　洪涝灾害给农作物造成了很大的损失，仅南亚地区每年有超过15%的玉米（Zea mays L.）种植面积遭受不同程度的危害[1]。玉米是我国种植面积最大的农作物之一[2]，但由于南方地区季节性降雨，玉米苗期经常遭受绵绵春雨，花期和灌浆期则往往遭遇梅雨，排灌系统不良、低洼地区的春玉米经常遭受洪涝灾害。我国受洪涝灾害的农田面积平均每年达956万hm2，其中严重的年份，受灾面积达1 500万hm2以上[3]。 　　乙烯反应因子（Ethylene response factors，ERF）是乙烯信号途径调控的重要因子，参与植物生物和非生物胁迫的表达调控[4-6]。研究发现ERF基因参与了水稻（Oryza sative L.）和深水稻的淹水胁迫响应。在淹水条件下Sub1A基因可以抑制乙烯的产生，限制叶片和节间的伸长，降低叶绿素的降解和碳水化合物的消耗，而使水稻生长处于“静止”状态，并在退水后能迅速恢复生长[7]。Xu等[8]克隆了Sub1A基因，并通过转基因技术将Sub1A基因导入到不耐淹水的粳稻材料中，提高了耐淹水性。Hattori等[9]从深水稻中克隆了2个ERF基因，分别是SNORKEL1和SNORKEL2。淹水条件下，深水稻体内乙烯的积累，诱导了SNORKEL1和SNORKEL2基因的表达，促进了节间的显著伸长，从而使深水稻的茎秆伸出水面，避免遭受溺亡。拟南芥（Arabidopsis thaliana）RAP2.2也是一个ERF基因，在根部表达量较高。转基因结果证实上调RAP2.2基因的表达，提高了拟南芥耐淹水性，相反敲除RAP2.2基因，拟南芥对淹水非常敏感；同时，RAP2.2基因上调表达的转基因株???，其ADH1和PDC酶的活性较高[10]。 　　以上研究表明，ERF基因参与了水稻、深水稻和拟南芥的淹水胁迫响应，是耐淹涝的关键基因。课题组使用生物信息学方法，从玉米基因组中获得了107个ERF基因，并使用RNA-seq技术，分析了这些基因在玉米自交系Hz32（耐渍系）根系不同淹水条件下的表达情况，发现ZmERF2基因受淹水胁迫诱导表达（待发表）。本研究分别从玉米自交系Hz32和Mo17（敏感系）中克隆出了ZmERF2基因的启动子，并对该启动子进行了生物信息学分析，将有助于进一步揭示玉米耐渍性形成的分子机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　耐渍性较强的玉米自交系Hz32和耐渍性较弱的玉米自交系Mo17，均由华中农业大学张祖新教授惠赠。 　　1.2 方法 　　1.2.1 玉米基因组DNA的提取 利用改进的CTAB法[11]分别提取玉米自交系Hz32和Mo17的基因组DNA。 　　1.2.2 玉米根系总RNA的提取与cDNA第一链的合成 玉米自交系Mo17、Hz32于三叶一心期，分别进行0、4 h的淹水处理。使用植物总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），分别提取各处理根系的总RNA。将各处理的总RNA作为模板，使用cDNA第一链合成试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），分别合成cDNA第一链。 　　1.2.3 PCR引物的设计 根据玉米自交系B73 ZmERF5基因序列，分别设计用于RT-PCR和PCR扩增的引物，引物序列见表1。引物GSP1-F、GSP1-R用于RT-PCR，分析不同淹水处理ZmERF5基因在Mo17、Hz32根系的表达情况。引物GSP2-F、GSP2-R用于PCR扩增ZmERF5基因启动子。 　　1.2.4 ZmERF5基因表达的RT-PCR分析 分别提取淹水0、4 h处理的Mo17、Hz32根系总RNA，并分别合成cDNA第一链。将合成的cDNA第一链作为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR扩增体系为：10×Taq Buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNT